Development of anti-integrin cyclic peptides and anti-EGFR monobody for specific delivery of payloads into targeted tumors

Abstract

항체모방체 (Antibody mimetics)는 항체만큼 높은 결합 특이성, 높은 친화도를 가지는 <br>항체 유사 스캐폴드이다. 고리형 펩타이드 (Cyclic peptide), 어피바디 (Affibody), <br>모노바디 (Monobody) 등 다양한 종류의 항체 모방체가 개발되었다. 항체모방체는 <br>항체와 비슷한 특징을 가지지만 작은 크기를 가진다는 특징을 가지고 있으며, 현재 <br>전임상 및 임상 연구에서 암 진단 및 치료제 개발을 위한 광범위한 연구가 진행중이다. <br>항체모방체의 이런 작은 크기는 항체 모방체들을 IgG 에 융합하여 다중 특이성 항체를 <br>제작하는 데에 사용된다. 나는 이 연구에서 항체모방체를 전달제로 사용하여 표적 <br>세포에 항체 또는 독소와 같은 단백질들을 효과적으로 전달할 수 있는 항체모방체를 <br>개발하는 연구를 진행하였다. 종양 관련 인테그린 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 <br>고형암에 과발현 된다는 특징이 있으며, 고형암 치료제 개발에 있어 상당히 매력적인 <br>표적이다. 나는 첫번째로, 우리 연구실에서 개발한 세포질 침투항체를 종양 관련 <br>인테그린을 발현하는 세포에 전달할 수 있는 효율을 증가시키기 위해 인테그린 <br>αvβ5 와 인테그린 αvβ6 을 특이적으로, 높은 결합친화도로 표적할 수 있는 고리형 <br>펩타이드를 개발하였다. 그렇지만 세포질침투항체가 세포질로 전달되는 양을 증가시키기 <br>위해서는 높은 결합친화도 뿐만 아니라, 엔도솜 환경에서 표적과 해리될 수 있도록 pH <br>의존적 결합능이 중요한 요소로 작용한다는 사실을 실험을 통해 확인하였다. 후속 <br>연구로 저는 원형펩타이드가 더 높은 pH-의존성을 가지며 표적 인테그린에 결합할 수 <br>있도록 이스트디스플레이를 이용하여 엔지니어링 하여 인테그린 αvβ6 에 대해서는 <br>높은 pH-의존적 결합을 가지는 클론을 선별하였지만 인테그린 αvβ5 에 대한 클론은 <br>선별할 수 없었다. 두번째 연구는, 첫 번째와 유사한 접근 방식으로 EGFR 을 표적으로 <br>하여 세포질 침투항체를 전달하는 연구를 진행하였다. EGFR 을 표적으로 하는 고리형 <br>펩티드, 어피바디 및 모노바디를 스크리닝하여 최적의 항체모조물을 검증과정을 통해 <br>선별하였다. 고리형 펩타이드는 EGFR 에 특이적으로 결합하였으며 EGFR 에 결합하여 <br>세포 내재화까지 유도하였으나, EGFR 에 대한 너무 낮은 친화도를 가지고 있어서 <br>적합하지 않다고 판단하였다. 또한, 어피바디의 경우, 높은 친화도를 가졌으나, 세포질 <br>침투항체가 세포질로 이동하는 효율이 매우 낮았으며, 앞서 연구했던 결과와 일치하게 <br>pH-의존적 결합이 보이지 않아서 그런 것이라 판단하였다. 모노바디는 높은 친화도와 <br>어느 정도의 pH-의존적 결합을 보여 in4-Ras03 와 유사한 정도의 세포질 이동 <br>효율을 가지는 것을 확인하였다. 앞선 결과들을 토대로 추후 연구의 탬플릿으로 <br>모노바디를 선정하였다. 모노바디의 파라토프에 각각 히스티딘 스캐닝을 수행하여 <br>얻어진 결과를 토대로 단일 돌연변이들의 조합을 이용하여 pH 의존성을 극대화시킨 <br>ERv3 클론을 제작하였다. ERv3-Ras03 은 야생형 모노바디를 융합한 ER-Ras03 에 <br>비해 pH 6.0 에서 10 배 더 빠르게 해리되는 결과를 보여줬다. 또한, ERv3-Ras03 은 <br>in4-Ras03 에 비해 세포질로 이동하는 항체의 양이 증가된 것으로 확인되었다. <br>마지막으로, 다양한 EGFR 발현 수준에서 정상 조직 및 종양 세포에 대해 선택적으로 <br>결합할 수 있도록, EGFR 친화도를 미세 조정하여 확대된 치료 범위를 갖는 EGFR 를 <br>표적하는 면역독소를 개발하였다. EGFR 은 종양세포에 과발현 되지만 일반 세포에도 <br>어느정도 발현된다는 문제점을 가지고 있어 세포독성 효과가 높은 약을 사용할 경우 <br>매우 좁은 치료범위를 가진다는 한계점을 가지고 있다. 나는 이러한 한계점을 극복하기 <br>위해, EGF 에 대해 다양한 친화도를 가지는 면역독소를 개발하였고, 이를 EGFR 을 <br>과발현하는 종양조직과 일반세포 수준으로 발현하는 세포를 이용하여 실험하여 약 20 <br>nM 정도의 EGFR 친화도를 가지는 면역독소가 in vitro 실험에서 가장 넓은 치료범위를 <br>보이는 것을 확인하였으며, 본 클론을 이용하여 동물실험에서의 독소와 치료효과를 <br>확인한 결과, 높은 친화도를 가지는 면역독소보다 친화도를 조절한 면역독소가 약 4 배 <br>더 넓은 치료범위를 가지는 것을 확인하였다. 상기 학위 과정 동안 나는 종양 관련 <br>인테그린을 표적하는 원형 펩타이드 및 EGFR 을 표적하는 모노바디를 엔지니어링 <br>함으로써 세포질 침투항체를 인테그린과 EGFR 이 과발현된 세포에 더 많이 전달될 수 <br>있도록 개량하였으며, 슈도모나스 유래 독소를 EGFR 발현 종양세포에 조금 더 <br>특이적으로 전달할 수 있도록 개량하여, 궁극적으로 여러 단백질 페이로드들을 <br>종양세포로 잘 전달될 수 있도록 개량하는 연구를 진행하였으며, 이를 통해 종양에 여러 <br>페이로드 단백질들을 전달하도록 표적 도메인을 개량할 때 엔지니어링의 방향성을 <br>제시하였다.