Development of anti-integrin cyclic peptides and anti-EGFR monobody for specific delivery of payloads into targeted tumors - 전세용 (The Graduate School, Ajou University, 2023)
항체모방체 (Antibody mimetics)는 항체만큼 높은 결합 특이성, 높은 친화도를 가지는 항체 유사 스캐폴드이다. 고리형 펩타이드 (Cyclic peptide), 어피바디 (Affibody), 모노바디 (Monobody) 등 다양한 종류의 항체 모방체가 개발되었다. 항체모방체는 항체와 비슷한 특징을 가지지만 작은 크기를 가진다는 특징을 가지고 있으며, 현재 전임상 및 임상 연구에서 암 진단 및 치료제 개발을 위한 광범위한 연구가 진행중이다. 항체모방체의 이런 작은 크기는 항체 모방체들을 IgG 에 융합하여 다중 특이성 항체를 제작하는 데에 사용된다. 나는 이 연구에서 항체모방체를 전달제로 사용하여 표적 세포에 항체 또는 독소와 같은 단백질들을 효과적으로 전달할 수 있는 항체모방체를 개발하는 연구를 진행하였다. 종양 관련 인테그린 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 고형암에 과발현 된다는 특징이 있으며, 고형암 치료제 개발에 있어 상당히 매력적인 표적이다. 나는 첫번째로, 우리 연구실에서 개발한 세포질 침투항체를 종양 관련 인테그린을 발현하는 세포에 전달할 수 있는 효율을 증가시키기 위해 인테그린 αvβ5 와 인테그린 αvβ6 을 특이적으로, 높은 결합친화도로 표적할 수 있는 고리형 펩타이드를 개발하였다. 그렇지만 세포질침투항체가 세포질로 전달되는 양을 증가시키기 위해서는 높은 결합친화도 뿐만 아니라, 엔도솜 환경에서 표적과 해리될 수 있도록 pH 의존적 결합능이 중요한 요소로 작용한다는 사실을 실험을 통해 확인하였다. 후속 연구로 저는 원형펩타이드가 더 높은 pH-의존성을 가지며 표적 인테그린에 결합할 수 있도록 이스트디스플레이를 이용하여 엔지니어링 하여 인테그린 αvβ6 에 대해서는 높은 pH-의존적 결합을 가지는 클론을 선별하였지만 인테그린 αvβ5 에 대한 클론은 선별할 수 없었다. 두번째 연구는, 첫 번째와 유사한 접근 방식으로 EGFR 을 표적으로 하여 세포질 침투항체를 전달하는 연구를 진행하였다. EGFR 을 표적으로 하는 고리형 펩티드, 어피바디 및 모노바디를 스크리닝하여 최적의 항체모조물을 검증과정을 통해 선별하였다. 고리형 펩타이드는 EGFR 에 특이적으로 결합하였으며 EGFR 에 결합하여 세포 내재화까지 유도하였으나, EGFR 에 대한 너무 낮은 친화도를 가지고 있어서 적합하지 않다고 판단하였다. 또한, 어피바디의 경우, 높은 친화도를 가졌으나, 세포질 침투항체가 세포질로 이동하는 효율이 매우 낮았으며, 앞서 연구했던 결과와 일치하게 pH-의존적 결합이 보이지 않아서 그런 것이라 판단하였다. 모노바디는 높은 친화도와 어느 정도의 pH-의존적 결합을 보여 in4-Ras03 와 유사한 정도의 세포질 이동 효율을 가지는 것을 확인하였다. 앞선 결과들을 토대로 추후 연구의 탬플릿으로 모노바디를 선정하였다. 모노바디의 파라토프에 각각 히스티딘 스캐닝을 수행하여 얻어진 결과를 토대로 단일 돌연변이들의 조합을 이용하여 pH 의존성을 극대화시킨 ERv3 클론을 제작하였다. ERv3-Ras03 은 야생형 모노바디를 융합한 ER-Ras03 에 비해 pH 6.0 에서 10 배 더 빠르게 해리되는 결과를 보여줬다. 또한, ERv3-Ras03 은 in4-Ras03 에 비해 세포질로 이동하는 항체의 양이 증가된 것으로 확인되었다. 마지막으로, 다양한 EGFR 발현 수준에서 정상 조직 및 종양 세포에 대해 선택적으로 결합할 수 있도록, EGFR 친화도를 미세 조정하여 확대된 치료 범위를 갖는 EGFR 를 표적하는 면역독소를 개발하였다. EGFR 은 종양세포에 과발현 되지만 일반 세포에도 어느정도 발현된다는 문제점을 가지고 있어 세포독성 효과가 높은 약을 사용할 경우 매우 좁은 치료범위를 가진다는 한계점을 가지고 있다. 나는 이러한 한계점을 극복하기 위해, EGF 에 대해 다양한 친화도를 가지는 면역독소를 개발하였고, 이를 EGFR 을 과발현하는 종양조직과 일반세포 수준으로 발현하는 세포를 이용하여 실험하여 약 20 nM 정도의 EGFR 친화도를 가지는 면역독소가 in vitro 실험에서 가장 넓은 치료범위를 보이는 것을 확인하였으며, 본 클론을 이용하여 동물실험에서의 독소와 치료효과를 확인한 결과, 높은 친화도를 가지는 면역독소보다 친화도를 조절한 면역독소가 약 4 배 더 넓은 치료범위를 가지는 것을 확인하였다. 상기 학위 과정 동안 나는 종양 관련 인테그린을 표적하는 원형 펩타이드 및 EGFR 을 표적하는 모노바디를 엔지니어링 함으로써 세포질 침투항체를 인테그린과 EGFR 이 과발현된 세포에 더 많이 전달될 수 있도록 개량하였으며, 슈도모나스 유래 독소를 EGFR 발현 종양세포에 조금 더 특이적으로 전달할 수 있도록 개량하여, 궁극적으로 여러 단백질 페이로드들을 종양세포로 잘 전달될 수 있도록 개량하는 연구를 진행하였으며, 이를 통해 종양에 여러 페이로드 단백질들을 전달하도록 표적 도메인을 개량할 때 엔지니어링의 방향성을 제시하였다.
학위논문(박사)--분자과학기술학과,2023. 2
Keywords: Cyclic peptide; EGFR; immunotoxin; integrin; monobody