자가면역항체 (autoantibody)의 세포질내 유입은 전신성 홍반루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)의 질병 활동과 밀접한 관련이 있다고 추측되지만, 환자 혈청에서 유래한 세포질로 이동하는 항체를 정량하는 방법이 없기 때문에 연관성을 확인할 수 없었다. 지금까지 세포 내 항체를 정량하는 임상적인 방법은 세포질로 유입된 항체를 구분하지 못하였다. 또한 세포질로 유입된 항체를 구분하는 다른 방법들은 항체에 태그(tag)를 연결하는 과정을 필요로 하기 때문에, 항체의 서열을 모르는 환자유래 (patient-derived) 자가면역항체 분석에는 적용될 수 없었다. 따라서 본 저자는 THP-1 세포주의 세포내 Fc 의존적인 NF-κB 활성화 경로에 기초해서 태그가 필요없는 정량방법인 CLASS version 4를 개발하였다. 반딧불이 루시퍼레이즈 (firefly luciferase)를 안정적으로 발현하는 THP-1 리포터 세포주 (reporter cell line)을 구축해서 세포질로 이동하는 항체를 정량하였다. CLASS version 4는 4시간의 항체처리시간에서 가장 강한 발광신호를 보였고, 세포배양배지를 제거하는 반딧불이 루시퍼레이즈 (firefly luciferase) 수행키트 (assay kit)로 신호를 검출했을 때 가장 높은 민감도를 보여주었다. CLASS version 4에 의해 검출된 발광신호는 모델항체로 사용된 3D8 IgG의1 μM 부터 15.625 nM 범위에서 농도에 따라 비례하는 경향성을 보였다. 또한 혈청으로부터 분리해낸 IgG에 3D8 IgG을 섞어서 정량하였을 때도 3D8 IgG의 1 μM 부터 15.625 nM 농도 범위에서 여전히 농도의존적으로 발광세기가 증가하였다. CLASS version 4는 SLE 환자에서 얻은 혈청으로부터 세포질로 이동하는 자가면역항체의 양을 측정할 수 있을 것으로 추측되며, 자가면역항체의 세포질내 유입과 SLE의 질병 활동과의 관계를 이해하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.|A subset of antinuclear antibody (ANA), a hallmark of systemic lupus erythematosus (SLE), triggers the production of pro-inflammatory cytokine through its cell-internalization. While it is speculated that the internalization of ANA is closely linked to disease activity in SLE, there is no method to quantify the naked form of cytosol-internalizing ANA derived from patient serum. The methods for quantifying intracellular antibodies so far have relied on antibody tagging. Therefore, I developed a cell-based biosensor to measure cytosol- internalizing ANA without modifying antibody molecules, based on the activation of the cytosolic Fc receptor-NF-κB axis signaling pathway upon antibody internalization. I assessed luminescence by treating stable THP-1 cells expressing NF-κB luciferase reporter gene with various concentrations of a cytosol-internalizing reference antibody. The results demonstrated a low limit of detection (~15.625 nM) under both conditions of treating the reference antibody alone and co-treating the reference antibody with polyclonal human IgG. Although sensitivity improvements are still required, I expect this method to enable the quantification of cytosol-internalizing ANA from SLE patient serum, aiding in understanding the relationship between ANA internalization and disease activity in SLE. Keywords: internalizing antibodies, biosensors, quantitative measurement, untagged antibodies
Alternative Abstract
자가면역항체 (autoantibody)의 세포질내 유입은 전신성 홍반루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE)의 질병 활동과 밀접한 관련이 있다고 추측되지만, 환자 혈청에서 유래한 세포질로 이동하는 항체를 정량하는 방법이 없기 때문에 연관성을 확인할 수 없었다. 지금까지 세포 내 항체를 정량하는 임상적인 방법은 세포질로 유입된 항체를 구분하지 못하였다. 또한 세포질로 유입된 항체를 구분하는 다른 방법들은 항체에 태그(tag)를 연결하는 과정을 필요로 하기 때문에, 항체의 서열을 모르는 환자유래 (patient-derived) 자가면역항체 분석에는 적용될 수 없었다. 따라서 본 저자는 THP-1 세포주의 세포내 Fc 의존적인 NF-κB 활성화 경로에 기초해서 태그가 필요없는 정량방법인 CLASS version 4를 개발하였다. 반딧불이 루시퍼레이즈 (firefly luciferase)를 안정적으로 발현하는 THP-1 리포터 세포주 (reporter cell line)을 구축해서 세포질로 이동하는 항체를 정량하였다. CLASS version 4는 4시간의 항체처리시간에서 가장 강한 발광신호를 보였고, 세포배양배지를 제거하는 반딧불이 루시퍼레이즈 (firefly luciferase) 수행키트 (assay kit)로 신호를 검출했을 때 가장 높은 민감도를 보여주었다. CLASS version 4에 의해 검출된 발광신호는 모델항체로 사용된 3D8 IgG의1 μM 부터 15.625 nM 범위에서 농도에 따라 비례하는 경향성을 보였다. 또한 혈청으로부터 분리해낸 IgG에 3D8 IgG을 섞어서 정량하였을 때도 3D8 IgG의 1 μM 부터 15.625 nM 농도 범위에서 여전히 농도의존적으로 발광세기가 증가하였다. CLASS version 4는 SLE 환자에서 얻은 혈청으로부터 세포질로 이동하는 자가면역항체의 양을 측정할 수 있을 것으로 추측되며, 자가면역항체의 세포질내 유입과 SLE의 질병 활동과의 관계를 이해하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
