HRP2 유전자 결실 돌연변이 열대열말라리아 항원 검출을 위한 신속진단키트의 개발 및 성능평가

Abstract

열대열말라리아(Plasmodium falciparum)는 인간에게 감염되는 말라리 아 5종 중 가장 치명적인 말라리아로, 높은 사망률을 일으키는 모기 매개 질 병이다. 신속진단키트(Rapid Diagnostic Test, RDT)는 이러한 말라리아 의 진단에 널리 사용되며, 특히 아시아, 아프리카 및 중남미 지역에서 중요 한 도구로 자리 잡고 있다. 열대열말라리아에 특이적으로 존재하는 히스티 딘 풍부 단백질 2(Histidine-Rich Protein 2, HRP2)는 오랫동안 진단의 주요 바이오마커(biomarker)로 사용되어 왔으나, 2010년 HRP2 유전자 돌 연변이가 보고되면서 HRP2 기반 신속진단키트의 신뢰성에 대한 우려가 커 지고 있다. 이를 해결하기 위해 젖산탈수소효소(Lactate dehydrogenase, LDH)를 표적으로 하는 대체 키트가 개발되었으나, HRP2의 검출 효율을 완 전히 대체하지는 못했다. 또한, 두 개의 검사선(test line)을 가진 대체 키트 들은 사용자 편의성 측면에서 불편함을 초래했다. 본 연구의 목적은 HRP2 의 높은 민감도, LDH의 돌연변이 대응력, 그리고 사용자 편의성을 동시에 만족시키는 신속진단키트를 개발하는 것이었다. 이를 위해 항체 쌍 선별시 험을 통해 HRP2와 LDH를 효율적으로 검출할 수 있는 두 쌍의 항체를 선별 하였으며, 검출 항체와 포획 항체의 최적화 시험을 통해 해당 항체들의 사용 조건을 확립하였다. 마지막으로 검체 전개액 최적화 시험을 통해 적혈구 내 열대열말라리아 원충이 효율적으로 노출되도록 유도하였다. 이러한 과정을 통해 HRP2와 LDH를 모두 검출 타깃으로 하면서 하나의 검사선으로 구성 된 신속진단키트를 개발하였다. 키트의 성능 평가는 WHO의 TSS-3 말라 리아 신속진단키트 성능평가 가이드라인에 따라 수행되었다. 개발된 키트는 NIBSC 국제 표준물질 기준 3.91 IU/㎖의 최소 검출 한계를 보였으며, HRP2/HRP3 결실 검체(HRP2-/HRP3-) 에서도 0.5 ng/㎖ 농도까지 검 출할 수 있음을 확인하였다. 분석적 특이도 시험에서는 HAMA 타입 1 혈청 을 제외한 모든 잠재적 간섭 및 교차 물질에서 특이도가 확인되었으며, 약 5 개월의 가속 노화 안정성 시험을 통해 키트의 잠재적 사용 기간이 2년임을 확인했다. 본 연구를 통해 개발된 키트는 HRP2 기반 신속진단키트의 높은 검출 효율, LDH 기반 신속진단키트의 돌연변이 대응력, 그리고 사용의 용이 성을 동시에 만족시켜, HRP2 유전자 결실 돌연변이가 확산하는 지역에서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.|Plasmodium falciparum is the most critical malaria of the five malaria species that infect humans, causing high mortality rates as a vector-borne disease. Rapid Diagnostic Tests (RDTs) are widely used for the diagnosis of malaria, particularly in Asia, Africa, and Latin America. Histidine-Rich Protein 2 (HRP2), which is specific to P. falciparum, has long been used as a primary biomarker for diagnosis. However, the reliability of HRP2-based RDTs has been questioned since the report of HRP2 gene mutations in 2010. In response to this issue, alternative kits targeting Lactate dehydrogenase (LDH) were developed, but they failed to replace due to the detection efficiency. Additionally, alternative kits with two test lines have caused user inconvenience. The purpose of this study was to develop an RDT that simultaneously satisfies the high sensitivity of HRP2, the mutation response of LDH, and user convenience. For development, two pairs of antibodies capable of efficiently detecting HRP2 and LDH were selected through antibody pairing tests. The optimal conditions for using these antibodies were established through optimization tests of detection and capture antibodies. Finally, the assay buffer solution was optimized to efficiently expose the malaria parasites in red blood cells. Through these processes, a RDT was developed, which targets both HRP2 and LDH with a single test line. The performance of the kit was evaluated according to the WHO's TSS-3 malaria RDT performance evaluation guidelines. The developed kit was found to have a limit of detection value of 3.91 IU/㎖ using the NIBSC international standard material, and was confirmed to be capable of detecting concentrations as low as 0.5 ng/㎖ in HRP2/HRP3 gene deleted cultured samples (HRP2-/HRP3-). Analytical specificity tests confirmed specificity for all potential interfering and cross-reactive substances, except for HAMA type 1 serum. Additionally, a potential shelf life of two years for the kit was confirmed through a five-month accelerated aging stability test. The kit developed through this study simultaneously satisfies the high detection efficiency of HRP2-based RDTs, the mutation response ability of the LDH-based RDTs, and the usability, and is expected to be useful in regions where HRP2 gene deletion mutations are spreading.