The RSF1-ATM-p53 signaling axis in conjunction with ATR or DNA-PK upon DNA damage - 김기은 (The Graduate School, Ajou University, 2023)
신경 발달 과정 중에는 다양한 DNA 손상이 발생되는데, 이러한 손상을 복구하는 과정인 DDR이 매우 중요하다. DDR의 돌연변이로 인하여 신경발달이 제대로 되지 못하게 되고 이는 인간의 유전적 질병으로 이어질 수가 있다. 이러한 유전적 질병들 중에서, A-T는 소뇌와 면역체계에 영향을 미치게 되는 질병이다. A-T는 ATM 돌연변이에 의해 발생된다. DNA 가닥이 끊어지면, ATM은 손상된 DNA에 recruit되어, 다른 하위신호들을 인산화시켜 세포사멸이나 세포주기를 정지시키기 위해 DDR을 활성화시킨다. ATM은 RSF1과 p53을 포함한 수많은 하위신호인자을 가지고 있다. RSF1은 RSF 복합체의 구성요소 중 하나로서 SNF2h와 함께 크로마틴 리모델링 및 전사 조절을 할 수 있는 단백질로 알려져 있다. 그래서 신경계, 특히 뇌 발달 과정에서 RSF1과 ATM의 연관성을 확인하기 위해 Nestin-Cre 동물을 사용하여 Rsf1 유전자를 선택적으로 제거하였다. Rsf1이 불활성화 되어도 신경발달에 영향을 미치지 않았고, 또한 Rsf1과 Atm의 이중 불활성화는 소뇌 실조증의 징후와 신경병리학적 결함을 초래하지 않았다. 그래서 동물 모델에게 DNA 손상을 주는 약물을 투여한 뒤, DNA손상복구를 확인하였다. Rsf1Nes-Cre와 Rsf1Nes-Cre;Atm-/-동물이 신경계에서 외부자극으로 유도된 DNA 손상에 의해 세포사멸이 감소됨을 확인하였다. 이러한 현상은 RSF1이 크로마틴을 열어주어 세포사멸에 중요한 유전자의 발현을 p53이 전사를 유도하지 못하여 발생되었음을 확인하였다. 다양한 실험을 하기 위하여 CRISPR-Cas9을 이용한 유전자재조합을 통해 U2OS 세포주에 RSF1, ATM 및 RSF1/ATM dKO세포주를 제작하였다. RSF1 또는 ATM 이 없는 세포는 느리게 증식하였고, RSF1/ATM dKO는 이보다 더 세포증식에 심각한 결함을 보였다. ATM과 같은 kinase인 ATR 과 DNA-PK 억제제를 처리한 뒤 DNA 손상복구 신호전달의 초기단계를 확인하였다. DNA 가닥 손상 또는 DNA replication stress를 유도하게 되면, ATM, ATR 및 DNA-PK에 의해 활성화된다. ETP 처리에 의해 유도된 replication stress에서 ATR 신호전달은 ATM KO에서 우세해졌지만 RSF1/ATM dKO 에서는 억제되었다. Phleomycin 처리에 의한 무작위 DNA DSB는 ATM KO 세포에서 DNA-PK 신호와 협력하여 보조적으로 ATR 의존적 신호전달을 유도하였다. RSF1/ATM dKO에서 ATR과 DNA-PK 사이의 이러한 협력은 약화되었다. 일반적으로 p53은 DNA strand break또는 replication stress 시 RSF1/ATM dKO에서 완전히 활성화되지 않았다. ATR 신호는 ATM 결핍일때, 대체적으로 작동될 수 있지만 RSF1/ATM dKO 에서는 완전히 활성화되지 못했다. 이는 RSF1 결핍으로 인해 compacted된 크로마틴 상태로 인하여, ATR kinase 기능을 활성화하기 위한 중요한 단계로 RPA가 ssDNA에 접근하기 어려워진 것이 아닌가 하는 가능성을 추측할 수가 있었다. 이에 대한 분자적 메커니즘을 검증하기 위해서는 아직 더 많은 분석이 필요하다.
학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2023. 2
Keywords: ATM; DNA damage response; DNA strand break; RSF1; p53