Engineering of EpCAM-targeting cyclic peptide and a U-box of E3 ligase E4B by yeast surface display - 박성욱 (The Graduate School, Ajou University, 2022)
암과 같은 질병을 치료하기 위한 목적으로 사용되는 치료약물의 표적 특이성은 치료 시 효과 못지않게 중요한 요소다. 일반적으로 질환 세포의 경우 정상 세포에서 유전자적, 단백질적 변이에 따라 발생하는 것으로, 서로 간에 많은 공통적 단백질을 가지고 있다. 따라서 표적 세포는 바람직하지 않은 부작용을 피하기 위해서는 질환 세포 특이적으로 정확하게 처리되어야 한다. 그동안 세포 특이적 약물 전달 접근법에 대한 많은 연구가 있었지만, 아직까지 정확한 정답은 존재하지 않고, 계속적으로 표적 특이적 수용체의 필요성이 이야기되고 있다. 본 연구는 세포 유형 특이성을 증가시키기 위한 고리형 펩타이드의 개발과, 세포 내부의 단백질을 제거하기 용이한 E3 연결효소를 엔지니어링하는 데 초점을 맞추고 이 두 가지 결과물을 이용하여 암을 비롯한 질병을 치료하기 위해 개발된 단백질의 사용법을 탐구한다. 본 연구에서는 항체에 종양세포 특이성을 부여하기 위해 효모표면표시 기술을 사용하여 EpCAM 수용체에 대해 특이성과 고친화성을 가지는 ep6 고리형 펩타이드를 개발했다. 개발된 ep6 고리형 펩타이드를 활성화된 Ras와 특이적으로 결합하는 항체(ep6Ras37)와 융합하고 발현을 위해 정제하였을 때, 물리적, 생물학적 기능의 저하가 발견되지 않았고, 야생형의 Ep133 펩타이드와 비교하여 EpCAM에 대한 친화력이 약 10배 증가하였다. 또한 ep6Ras37를 이용한 생체 내 실험에서 ep6Ras37은 EpCAM 수용체를 발현하는 Lovo 암세포를 이종 이식한 마우스 모델에서 종양 표적능 및 종양 내부의 축적이 증가했음을 확인하였다. 이후 E2-유비퀴틴 복합체(E2-Ub)와 상호작용하고 알로스테릭 자극을 통해 유비퀴틴 전달을 향상시키는 유비퀴틴 E3 연결효소인 E4BU(#8)를 설계했다. 이는 베이스로 사용된 E4BU(NT)에 비해 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화 속도를 증가시키는 것을 확인하였다. 추가 실험을 통해 E4BU(#8) 단백질의 E3 라이게이즈로써, 표적 단백질로의 유비퀴틴 전달 속도가 E4BU(NT)과 비교하였을 때, 약 3배 빠르다는 것이 확인되었다. 위에서 연구된 EpCAM 수용체를 표적하는 고리형 펩타이드, ep6와 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화 속도가 증가된 E4BU(#8)를 적용하는 방법을 설계하였다. 설계된 치료용 항체의 목적은 치료용 항체의 경쇄부분의 N 말단과 C 말단에서 각각 ep6 고리형 펩타이드와 E4BU(#8)를 융합하는 것이다. ep6와 E4BU(#8)이 융합된 치료용 항체는, ep6 고리형 펩타이드를 통해 종양 세포를 인식하며, 엔도좀 탈출능을 통해 세포 내부에 위치한다. 항체의 중쇄 특이적으로 표적 단백질에 결합할 수 있으며, E4BU(#8)에 의해 매개되는 폴리유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해를 통해서 세포 내부의 표적 단백질을 효율적으로 제거할 수 있는 기작을 가질 것으로 예상한다. 세포 내부의 특정 표적 단백질을 제거하는 기술이 개발되면 효과적인 종양 치료로 이어져 세포독성 등 부작용을 줄일 수 있다. 즉, 대상 단백질의 분해를 유도할 수 있는 E3 ligase인 E4BU(#8)의 개발과 함께 종양특이적 수용체인 EpCAM을 표적화할 수 있는 고리형 펩타이드를 사용한 치료용 항체의 개발은 새로운 질병 치료법 개발로 이어질 수 있을 것이고, 추가적인 연구를 통해 보다 더 효율적인 치료용 항체의 개발이 가능 할 것으로 전망한다.
학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2022. 8
Keywords: Cyclic peptide; E3 ligase; E4BU; EpCAM