Kinesin 18B에 결합하는 단백질에 대한 연구 - 김혜진 (The Graduate School, Ajou University, 2006)
목적 : Kinesin은 microtubule의 plus end 방향으로 세포내 소기관을 실어 나르는 운동단백질이다. 현재 kinesin의 종류는 약 200가지 이상으로 알려져 있으며 각각 다른 cargo를 운반하며 세포내 소기관 수송 외에 세포내 신호전달, meiosis, mitosis등에도 역할을 하는 것으로 알려 져 있다. 본 논문에서 사용된 kinesin18B는 KIF(kinesin superfamily)의 motor부분에서 얻은 kinesin으로 mouse KIF18B의 motor 부분과 homology가 있어 임시로 kinesin18B라 이름을 붙였다. Kinesin18B의 세포내 위치를 확인한 결과 원형질막 부분의 몇 부분과 핵에 위치하고 있음을 알 수 있었다. Kinesin18B의 head부분 중 약 600bp를 없앤 후 세포내 위치를 확인해본 결과 원형질막에는 보이지 않고 핵에만 집중되어 있는 것을 알 수 있었고, 이 결과로 보아 head의 약 600bp되는 부분이 특별한 기능을 가지고 있을 거라고 예상되어 이 부분과 결합하는 세포 단백질을 분리하여 이 세포단백질과 kinesin18B의 결합을 확인하고 그 특성을 밝히고자 하였다. 재료 및 방법 : Kinesin18B head 600bp부분과 결합하는 특정 단백질은 Yeast Two-Hybrid system을 이용하여 얻었다. Bait로 pGBT9/kinesin18B(654-842)를 사용하였고 prey로 pACT2/HeLa library를 사용 하였다. β- galactosidase filter assay를 실행 하여 가능성 있는 콜로니를 얻었고 이 콜로니들이 갖고 있는 pGBT9 vector에 있는 콜로니를 가려내기 위해 선별작업을 하였다. 선별작업 후 pACT2vector에 실려있을 콜로니에서 DNA를 얻었으며 restriction enzyme digestion으로 insert를 확인하였다. Insert 확인 후 sequencing을 하였고 그 결과를 NCBI site에서 homology search를 하였다. 그 결과 중 kinesin과 연관이 있을 가능성이 큰 protein을 정해 확실한 결합여부를 알기 위하여 positive control과 함께 다시 Yeast Two-Hybrid system을 시행 하였으며 그 후 GST Pull-down과 Immunoprecipitation을 실행 하였다. 결과 : Yeast Two-Hybrid system을 수행 하고 β-galactosidase filter assay를 한 결과 가능성이 보이는 43개의 파란색 콜로니를 얻었다. 그 콜로니들에서 DNA를 얻어 enzyme digestion으로 확실한 insert확인을 하여 26개를 얻게 되었다. 26개의 DNA를 sequencing을 하고 그 결과를 NCBI에서 homology search를 하였다. 그 결과로 8종류, 26개의 DNA를 얻었으며 그 중 Microtubule - associated protein RP/EB family member 1(이하 EB1)을 중심으로 kinesin18B와의 결합여부를 재확인 하게 되었다. Yeast Two-Hybrid system으로 재확인을 한 결과 파란색 콜로니로 결합 여부를 확인할 수 있었으며 positive control도 파란색 콜로니를 띄었고 pGBT9/18B(654-842)와 pACT2vector, pGBT9vector와 pACT2/EB1, pACT2vector와 pGBT9vector는 각각 하얀색 콜로니를 띄고 있음을 확인하였다. GST Pull-down과 IP에서도 각각 in vitro와 in vivo interaction을 확인할 수 있었다. 결론 : Kinesin18B(654-842)와 EB1, Kinesin18B와 EB1의 결합여부가 in vitro에서 확인이 되었으며 나아가 in vivo 상태에서도 확인이 되었다. 그리고 kinesin18B ORF와 EB1 ORF의 결합여부도 in vivo상태에서 확인이 되었다.
학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의학과,2006. 2
Keywords: EB1; GST pull-down; Immunoprecipitation; Kinesin; Yeast Two-Hybrid system