한국인 혈우병 A 환자에서 원인 유전자의 유전자형 분석 및 억제적 항체 발생에 관한 연구 - 황성호 (The Graduate School, Ajou University, 2010)
이론적 배경 혈우병 A은 X-염색체에 연관된 출혈성 질환으로, 발병율은 5000명 남아 중 1명에게서 나타난다. 혈우병 A의 원인은 8번 혈액 응고인자의 기능 상실이다. 8번 혈액응고인자의 유전자 (F8)은 약 180kb로 매우 크며, 26개의 엑손으로 구성되어 구조적으로 복잡하다. 다른 유전질환과 유사하게, 혈우병A에서도 다양한 돌연변이가 발견되는데 그 종류는 인트론 1, 인트론 22에서 나타나는 상동성 재조합 (역위), 점돌연변이, 결실, 그리고 삽입이다. HAMSTeRS에 현재까지 보고된 돌연변이의 종류는 약 900여 종 이상이다. 또한 혈우병 치료에 새로운 난점으로 나타난 것이 억제적 항체 발생이다. 이러한 항체 환자는 혈액응고인자 보충요법에 저항성을 보인다. 최근 F8유전자 형과 개별환자의 면역 시스템관련 유전자가 항체 발생의 결정적인 위험인자로 나타난다는 보고가 있다. 목적 F8 유전자형은 혈우병의 분자적 진단과 항체 발생의 위험인자의 예측에 있어서 중요하다. 하지만 한국 혈우병 환자의 유전자형 데이터 베이스가 부족하다. 그러므로 F8 유전자형의 조사가 필요하다. 또한, 많은 연구자들이 억제적 항체 발생과정을 설명하고 있다. 그럼에도 불구하고 항체 발생의 원인은 아직 잘 모르고 있다. 그러므로 본 연구자는 항체 환자와 비항체 환자사이의 차등 발현되는 유전자를 조사하고자 한다. 세번째 목적은 새로운 8인자 단백질 다형성 검출 기법의 개발에 관한 것이다. 많은 분자생물학적 진단기법에도 불구하고 좀더 직접적인 진단기법이 보인자 검사와 산전검사에 필요하다. 재료 및 방법 F8 돌연변이 검사를 위해 다음과 같은 4단계 조사 방법을 시행하였다; long distance-PCR (인트론 22 역위 조사), multiplex-PCR(인트론 1 역위 조사, 엑손 결손 조사), 직접염기 분석법(염기서열 변이 조사). F8 유전자형 조사의 대상은 38명의 한국인 혈우병 A환자를 대상으로 하였다. 또한, 항체 환자와 비항체 환자 사이의 차등발현 유전자를 조사하였다. 차등발현 유전자의 조사를 위해 전체 유전체 발현을 2명의 비항체 환자와 5명의 항체 환자를 대상으로 하여 미세배열 방법을 사용하였다. 차등발현된 유전자의 검증을 위해 반정량적 RT-PCR법을 이용하여 CXCL5, PTGS1, C1QB1, CCL3L3, PPBP, 그리고 IL8 유전자의 발현을 조사하였다. 새로운 8인자 단백질 다형성 검출법 개발을 위해, F8 유전자를 pGEX4T-2 운반체에 클로닝하였다. 클로닝된 F8 유전자는 과발현시키고 정제한 후 도메인 특이적 항체 생산의 항원으로 사용할 것이다. 결과 이번 연구에서 38명에게서 33개의 돌연변이를 확인할 수 있었다. 이중 15명(39.5%)의 인트론 22역위, 1명(2.6%)의 인트론 1 역위, 1명(2.6%)의 대결손, 5명(13.2%)의 결실, 2명(5.3%)의 삽입, 6명(15.8%)의 과오돌연변이, 그리고 3명(7.9%)의 무의미 돌연변이를 확인하였다. 5명의 환자에서는 돌연변이를 확인할 수 없었다. 또한 차등발현 유전자 조사 결과 항체 환자에서 384개의 유전자의 발현이 증가하였고, 161개의 유전자의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 총 545개의 차등발현 유전자를 PANTHER 분류법에 따라 분류하였다. 예상했던 것과 같이 신호전달과 면역관련 유전자의 발현 변화가 항체 환자에서 두드러지게 나타났다. 이러한 발견을 확인하기 위해 7개의 선별된 유전자를 반정량적 RT-PCR을 통해서 확인해보았다. 이중 C1QB1과 PTGS1유전자가 항체 환자에서 차등발현 되었고, CXCL5유전자는 크게 다르지 않았다. 다른 4개의 유전자의 발현은 미세배열결과와 유사하게 나타났다. 특히 PTGS1 유전자는 항체 환자에게서 두드러지게 발현변화가 나타났다. 결론 본 연구는 한국인 혈우병 환자에서 나타나는 F8의 유전자형을 조사하였다. 이 돌연변이 중 인트론 22의 역위가 가장 일반적인 형태였으며 이는 다른 연구와 같은 결과이다. 한국인 혈우병 A환자에서는 처음으로 인트론 1역위를 확인할 수 있었다. 또한, HAMSTeRS에 등록되지 않은 8명의 신규 돌연변이를 확인 할 수 있었다. 이번 연구에서 사용된 돌연변이 결과는 한국인 혈우병의 진단과 보인자 검사의 좋은 참고자료로 사용될 수 있을 것이다. 또한 전체 유전자 발현 조사 결과는 면역관련 유전자와 신호전달 관연 유전자의 발현 변화가 항체 환자에서 두드러지게 변화한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이러한 현상이 항체를 유발할 수 있는 인자인지 항체 발생에 따른 이차적인 현상인지 설명할 수 없었다. 그러므로 차등발현 유전자와 항체 발생의 민감성과의 상관관계를 밝히기 위해선 추가적인 연구가 필요하다.
학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :생명과학과,2010. 8
Keywords: 혈우병