허혈성 뇌졸중 쥐에서의 인간 중간엽 줄기세포를 이식 후 치료효과의 분석 - 이문옥 (The Graduate School, Ajou University, 2008)
허혈성 뇌졸중은 뇌로 전달되는 혈관이 막힘으로 치명적인 뇌기능의 손실을 초래하며, 성인에게 신체적 결함을 일으키는 가장 큰 원인 중에 하나이다. 최근 세포대체 요법으로 주목을 받고 있는 줄기세포는 질병으로 인해 손상된 조직이 회복되기 위한 생물학적인 대체 세포를 제공한다는 측면에서 뇌졸중 치료에 새로운 가능성을 제시하고 있다. 본 연구에서는 뇌졸중 쥐에 인간 유래 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells, MSCs)을 정맥으로 주입함으로써 줄기세포의 치료효과 및 그 기전을 관찰하려고 한다. 실험 I: 뇌졸중 환자와 같이 임상치료에 자가이식이 가능한 MSC 는 체외 배양으로 세포 수를 확장하여 이용한다. 하지만 배양횟수가 신경재생과 영양공급에 대한 영향은 잘 규명되어있지 않다. 본 실험에서는 MSCs passage 가 뇌졸중 동물모델에 미치는 영향을 연구하였다. 뇌졸중 쥐의 꼬리 정맥으로 서로 다른 passage 의 MSCs 를 주입한 결과 초기 passage 의 MSC 를 주입한 군에서 손상된 신경학적 행동변화가 회복되었고 신경재생이 증가되는 것을 관찰하였다. 일부 hMSCs 는 신경세포로 분화되는 것을 관찰되었으며, 또한 신경 영양인자로 알려진 glial cell-line-derived neurotrophic factor(GDNF), nerve growth factor(NGF), vascular endothelial growth factor(VEGF), hepatocyte growth factor(HGF) 등의 영양인자는 초기 passage 의 MSC 를 처리한 뇌에서 후기 passage MSCs 를 처리한 군에 비해 발현 양이 현저히 증가됨을 관찰하였다. 따라서 초기 passage hMSCs 가 후기 passage hMSCs 보다 신경재생뿐만 아니라 영양인자의 증가와 같은 여러 면에서 탁월한 효과를 나타내었다. 실험 II: hMSC를 처리한 허혈성 뇌졸중에서의 분자생물학적 변화를 연구하기 위해, 최신 기법인 프로티오믹스(proteomic) 방법을 이용하여 sham, transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) 그룹과 hMSCs를 처리한 tMCAo 그 룹간의 단백질 발현 정도를 비교하였다. 2-Dimensinal Electrophoresis(2-DE)와 matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) 분석을 이용하여 세 그룹간 발현 정도가 다른 14개의 단백 질을 규명하였다. 그 중 11개의 단백질은 hMSC 처리한 tMCAo 그룹에서 현저 하게 증가 혹은 감소 되였고, 3개의 단백질은 hMSC 처리한 그룹에서 정상 쥐와 비슷하게 회복 되였다. 이런 2-DE의 결과는 Western blot으로 재현됨을 확인하 였다. hMSCs에 의해 증가된 단백질 중에는 Annexin A3, GRP78과 같은 angiogenesis 와 신경보호 작용에 도움을 주는 단백질이 관찰되었다. Synaptosomal-associated protein 25(SNAP-25)와 transitional endoplasmic reticulum ATPase 와 같은 단백질은 hMSCs 처리한 군에서 정상 수준으로 회 복 되였는데 이런 단백질은 신경세포의 손상이나 apoptosis 에 관여 하는 것으 로 알려져 있다. 이러한 프로티오믹스 프로필링 연구는 향후 뇌졸중 치료에 있어 서 MSC 의 작용기전을 연구하고 해석하는데 도움이 될 것으로 사료된다. 실험 III: MSC는 뇌졸중 치료에서 손상된 뇌 기능을 회복하는데 유익하다고 보고 되어있다. 이런 MSC의 치료효과는 대사체의 변화에서도 반영될 것으로 추 측된다. 본 실험에서는 허혈성 뇌졸중 쥐에 human MSCs (hMSCs) 이식한 후, 뇌와 혈장에서의 대사체의 변화를 분석하여 hMSCs의 치료효과를 관찰하려고 한 다. 먼저 뇌졸중 (middle cerebral artery occlusion, MCAo) 동물모델을 수립하 여 hMSC를 이식 후, 쥐의 뇌조직과 혈장을 채취하여 생물화학적으로 중요한 지 표로 알려진 24종류의 유리 지방산(free fatty acids)의 변화를 관찰하였다. 혈장 에서는 myristic acid, 뇌에서는 linoleic acid, eicosenoic acids 와 같은 지방산 이 허혈성 뇌졸중 쥐의 그룹에 비해 hMSC 처리한 허혈성 뇌졸중 쥐의 그룹에서 현저히 감소되었다. 이런 대사체학적인 접근은 MSCs를 이식한 뇌졸중 치료과정 에서 일어나는 복잡한 생화학적, 생리학적 변화를 이해하는데 도움이 될 뿐만 아 니라 뇌졸중에서의 hMSCs 치료효과를 모니터링 하는데 유용할 것으로 사료된다.
학위논문(박사)----아주대학교 일반대학원 :의학과,2008. 2
Keywords: Ischemic stroke; Mesenchymal stem cells; Neurogenesis; Passage; 2-dimensinal electrophoresis; Proteomics; Fatty acids; Gas chromatography-mass spectrometry.