척수소뇌성운동실조증 제7형(SCA7)에 대한 분자유전학적 분석 및 RNA 간섭 효과 연구 - 장석훈 (The Graduate School, Ajou University, 2008)
척수소뇌성운동실조증 제7형(SCA7) 또는 상염색체우성 소뇌성운동실조증 제II형(ADCA II)은 주로 소뇌와 망막의 이상기능과 퇴행에 의한 소뇌성 운동실조와 실명을 임상적 특징으로 하는 상염색체 우성의 진행성 신경퇴행질환이다. SCA7의 유병률은 전세계적으로 인구 약 1,000,000명 당 1-4명이다. SCA7은 Ataxin-7 단백질을 코드하는 ATXN7 유전자 내의 불안정한 CAG 반복서열의 확장으로 유발된다. 정상 ATXN7 대립유전자에서 CAG 반복서열의 수는 4-35개이다. 돌연변이 대립유전자의 CAG 확장범위는 36에서 460개이며, 이러한 CAG 반복서열 수는 질병발병의 나이와 반비례를 보인다. 하지만 28-35개의 CAG를 갖는 중간형 대립유전자는 자식세대로 넘어가면서 CAG 반복서열이 확장되면서 돌연변이 대립유전자로 전환될 수 있다. Ataxin-7은 많은 CNS, 비 CNS 조직들에서 관찰되나 질병을 일으키는 증상들은 단지 몇 가지 신경계 세포(예를 들어 조롱박세포와 원뿔 및 막대 세포)에 국한된다. Ataxin-7의 기능은 완전히 밝혀지지 못하였으나 최근 들어 히스톤 아세틸전이효소의 활성을 갖는 전사 공동활성자복합체(TFTC 또는 STAGA)의 구성요소로 추정되고 있다. 현재까지도 SCA7을 포함한 폴리글루타민(poly Q) 질환에 효과적인 치료법은 개발되지 못하였다. 돌연변이 대립유전자 발현의 억제는 SCA7의 근본적인 치료법이 될 수 있다. 최근 들어 이중가닥의 RNA(dsRNA)로 유도되는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi)을 이용한 방법이 표적으로 하는 유전자의 발현을 억제하는 데에 매우 유용한 방법으로 대두되고 있다. 이러한 새로운 방법은 DNA 염기서열 특이적 유전자 억제를 위한 유일한 도구가 되며 폴리글루타민 질환과 같은 기능획득성(gain of function) 질환들에 있어서 부작용이 가장 적은 잠재적인 치료법이 될 수 있다. 이 연구에서 SCA7의 치료를 위해 돌연변이 ATXN7 대립유전자 특이적 또는 비특이적인 두 종류의 RNAi 시스템을 구축하고자 하였다. 돌연변이 대립유전자 특이적 RNAi 시스템을 제작하기위하여 ATXN7 유전자 내에 기존에 알려진 두 단일염기변이(SNP)를 이용하였다. 그 중 한 SNP(G 또는 A)는 엑손 12(ORF에 존재)에 위치하며 다른 한 SNP(G 또는 A)는 엑손 13(3‘-UTR에 존재)에 위치한다. 이들 두 SNP의 빈도를 한국인 SCA7 환자에서 밝히기 위해, 16명의 SCA7 환자들로부터 두 유형의 SNP의 빈도수를 분석하였다. 엑손 12의 A가 84%, G가 16%이었으며, 엑손 13의 경우는 반대로 G가 84%, A가 16%로 존재하였다. 이형접합률은 31.3%로서 나타났으며, 이것은 돌연변이 단백질 선별적 억제 치료가 가능한 수치이다. 최초 두 SNP 유형을 조합할 경우 보다 높은 이형접합률을 확보해 돌연변이 대립유전자 특이적 발현억제 RNAi에 보다 많은 환자의 적용이 가능하리라 판단하였다. 하지만 SNP 분석결과 엑손 12의 G와 엑손 13의 A가 서로 연관되어 있는 것으로 나타나 실제로 그 가능성은 높지 않은 것으로 밝혀졌다. 엑손 12의 G/A SNP를 이용하고자 A와 G를 타깃으로 하는 각각의 short hairpin RNA(shRNA) 발현 construct를 제작하였다. HeLa 세포에서 이들 두 RNAi construct RNAi-A와 RNAi-G는 SNP를 인지하는 대립유전자 특이적 방식으로 돌연변이 Ataxin-7(55Q)의 발현을 각각 약 80%, 50%까지 억제하였다. 또한 이러한 RNAi 적용시, 세포자멸사 유도제인 staurosporine(STS)에 의해 유도된 SK-N-SH(신경모세포종 세포주)의 세포자멸사의 진행이 억제되는 것을 일부 확인하였다. 다음으로, ATXN7 돌연변이 대립유전자 비특이적인 shRNA construct를 제작하였다. 이 중 하나가 Ataxin-7의 발현을 약 80%까지 감소시켰다. 상기의 두 가지 시스템으로 제작한 shRNA는 HeLa 세포에서 돌연변이 Ataxin-7(55Q)의 과발현에 의하여 형성된 핵포함체(응집)를 눈에 띄게 감소시켰다. 이러한 결과로부터 유추해 볼 때, 대립유전자 특이적 및 비특이적 돌연변이 Ataxin-7의 발현억제를 위한 두 RNAi 시스템을 조합하여 사용한다면, 추가적인 상승효과를 가져와 SCA7의 새로운 치료법으로서 큰 효과가 기대된다.
학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의학과,2008. 2
Keywords: 척수소; 뇌성운동실조증; SCA7; 분자유전학; RNA