최권영 김은주 2018-02 27131 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/11582 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :환경공학과,2018. 2 이 연구에서는 세계적으로 고분자에 대한 수요가 계속해서 증가하고 있고 지속 가능한 고분자 생산 공정의 필요성 또한 커지고 있는 추세에 따라 화학산업의 재생연료뿐만 아니라 고분자 합성을 위한 빌딩 블럭 역할을 하는데 필요한 ω-HFA(ω-hydroxy fatty acid)을 생산하고자 하였다. 하지만 화학적 전환으로는 가혹한 반응조건을 필요로 하고 부산물이 생성되므로 어려움이 있기 때문에 생체 촉매 전환(biocatalyst biotransformation) 을 이용하여 생산하고자 하였다. 재조합 대장균 BW25113 ∆fadD::pCDFduet-Alkane monooxygenase, fadL / pETduet-AlkG,T 동시발현system과 redox protein이 없는 BW25113 ∆fadD::pCDFduet-Alkane monooxygenase, fadL 단독발현 system을 이용하여 기질인 NAME(Nonanoic acid methyl ester)의 전환율을 비교하는 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 Alkane monooxygenase는 총 6 가지이다. 특히, FAEs(Fatty acid esters)에서 ω-HFA로의 전환을 효율적을 기능화 한다고 알려진 AlkB에서도 좋은 활성을 확인했기 때문에 우수한 전환율을 기대하였다. 그러나 생체 촉매 전환 실험을 통해 GC/MS 분석을 의뢰한 결과, 예상했던 생성물이 아닌 Ester가 떨어진 기질이 TMS 유도체화 된 물질이었다. 배양 조건과 분석 조건도 최적화하여 10 % 가량의 전환 된 생성물을 확인하였지만 더 이상의 기질은 생성물로 전환되지 않았다. 이러한 문제를 해결하지 못해 아직 다양한 monooxygenase의 전환율을 확인하지 못했지만 좋은 발현을 확인하였기 때문에 좋은 결과를 기대해도 될 것으로 예상된다. 제1장 서론 1 제1절 지방산 에스터 3 제2절 Alkane monooxygenase 4 제3절 반응 메커니즘 6 제2장 ω-HFA로의 생체 촉매 전환을 위한 실험 7 제1절 균주 및 화학 물질 재료 7 제2절 스크리닝과 클로닝 8 제3절 단백질 발현 12 제4절 생물전환반응에서의 적용 14 제5절 GC 분석 16 제3장 생체 촉매 전환 실험 결과 17 제1절 SDS-PAGE 결과 17 제2절 NAME에 대한 활성 확인 20 제3절 NAME의 생체 촉매 전환 확인 23 제4장 결론 및 토의 25 참고문헌 27 Abstract 30 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Methyl nonanoate의 ω-산화에 관여하는 alkane monooxygenases의 스크리닝과 증명 Screening and identification of alkane monooxygenases involved in ω-oxidation of methyl nonanoate Thesis 아주대학교 일반대학원 Eunjoo kim 일반대학원 환경공학과 2018. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000027131 Alkane monooxygenase Pseudomonas putida GPo1 methyl nonanoate 9-hydroxynonanoic acid. Fatty acid esters are renewable starting materials for production of ω-hydroxy fatty acid (ω-HFA). ω-HFA applications span over fuel and chemical industry, and as a building block for the synthesis of macromolecules. However, its synthesis by chemical means require harsh reaction conditions and results in formation of by-products which needs to be separated further. Prospective application of biological system and developing a systematic technology can answer the enhanced demand in the present and future needs worldwide. Hence in the present study production of ω-HFA using recombinant Escherichia coli by whole cell biotransformation was successfully demonstrated. The gene cluster AlkBGT derived from Pseudomonas putida GPo1 were systematically co-expressed to achieve the production of target product. In this system alkane monooxygenase is used together with redox partner which transfers electrons. Total of six alkane monooxygenases were screened from various sources were checked, and final product to 9-hydroxynonanoic acid accumulation was confirmed by GC analysis.