김문석 Kim, Gyeong Hae 2011-08 11819 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/10057 학위논문(석사)아주대학교 일반대학원 :생물공학과,2011. 8 약물 및 줄기세포의 전달을 위한 수분산계는 크게 물을 소량 함유하고 있는 하이드로겔과 나노입자약물전달체로 나눌 수 있다. 하이드로겔은 많은 수의 친수성기를 가지는 가교된 구조의 고분자로 이루어져있으며 물에 대한 친화도가 높아 생체적합성이기 때문에 약물전달, 조직공학, 세포배양 등에 널리 이용되고 있다. 나노입자약물전달체 중 하나인 자가미세유화(Self-microemulsifying system, SMES)는 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제 등을 이용하여 투명하고 안정한 형태의 등방성 혼합물을 말하며 생체적합성을 높여주고 체내 흡수율을 증진 시킨다. 본 연구에서는 첫 번째로 천연고분자인 키토산을 이용하여 신경계 약물인 valproic acid (VA)를 전달하고자 하였으며 VA의 전달을 쥐근육유래줄기세포(rat Muscle derived stem cells, rMDSCs)의 신경세포화 여부로 확인하고자 하였다. 두 번째로는 SMES를 이용하여 난용성 항암제인 도세탁셀(Docetaxel, Dtx)을 가용화하고 높은 안정성 및 항암효과를 갖도록 하고자 하였다. 키토산은 생체적합성 천연고분자이며 박테리아와 곰팡이에 대한 항균성이 있어 박테리아의 생성을 억제하는 효과를 가지고 있어 조직공학 및 약물전달용으로 연구가 활발히 진행되고 있다. 키토산은 산성용액에서 아민기가 양전하를 띄게 되고 β-Glycerolphosphate (β-GP)의 음전하와 정전기적 인력에 의하여 삼차원 망상구조를 이루게 된다. 이러한 키토산 하이드로겔을 이용하여 신경계 약물인 VA를 전달하고자 하였으며 이의 확인을 위하여 rMDSCs를 신경세포화 여부를 확인하고자 하였다. 키토산 하이드로겔은 상온에서는 졸 상태를 체온부근에서 겔 상태를 유지하였으며 rMDSCs를 키토산 하이드로겔에 파종하여 실험을 진행하였다. rMDSCs는 basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)와 VA에 의해 신경세포로 분화유도 되어 신경세포의 morphology를 가짐을 확인하였으며 세포면역화학적 염색을 통하여 신경세포에서 발현되는 Neuron Specific Enolase (NSE), Neurofilament (NF), Neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin (Tuj-1), Oligodendrocyte lineage transcription (Olig-2), Glial fibrillary acidic protein (GFAP), Neuronal specific nuclear protein (NeuN)이 대조군 보다 많은 양이 7 일까지 발현함을 확인하였다. 또한 VA에 대한 rMDSCs의 세포독성 테스트 결과 VA를 처리한 군은 대조군과 비교하였을 때 더 우수한 성장력을 보였고 이는 bFGF와 VA가 세포의 성장을 돕는다는 보고와 부합되는 결과로 보인다. VA의 전달에 의한 rMDSCs의 신경세포화를 확인하기 위하여 rMDSCs에서 분리한 단백질을 western blotting을 실시한 결과 대조군 대비 모두 VA를 처리한 군에서 모두 NSE, Tuj-1, Olig-2, GFAP, NeuN가 많은 양이 발현하였으나 7 일로 갈수록 발현양이 줄어듬을 확인 하였고 앞으로 장기 분화를 위한 조성의 media를 이용하여 rMDSCs의 신경분화실험을 진행할 예정이다. 다음으로 나노입자약물전달체 중 하나인 SMES를 이용하여 난용성 항암제인 Dtx를 가용화하고 그의 안정성 평가 및 B16F10 melanoma cell의 증식을 억제함을 확인하고자 하였다. Dtx-loaded SMES를 제조하기 위하여 가용화제, 계면활성제, 보조계면활성제, PLGA를 사용하였으며 제조된 Dtx-loaded SMES는 맑고 투명한 형태였다. Dtx-loaded SMES의 Dtx 봉입율은 70 % 이상으로 나타났으며 DLS와 AFM을 이용하여 사이즈 측정한 결과 80-100 nm로 나타났다. Dtx-loaded SMES의 안정성 테스트를 위하여 정제수와 BSA가 포함된 용액에 7 일간 37 oC에서 100rpm에서 보관한 결과 Dtx계열의 항암제인 Paclitaxel의 용액이며 대조약인 TaxolⓇ과 Dtx solution은 BSA가 포함된 용액에서 0 일부터 침전이 일어났으나 Dtx-loaded SMES는 침전 없이 7 일까지 안정함을 확인 하였다. 또한 Dtx-loaded SMES의 항암효과를 확인하기 위하여 B16F10 melanoma cell을 이용하여 세포독성테스트를 한 결과 대조군에서 큰 증식률을 보였으나 Dtx-loaded SMES의 F1-F3과 함께 배양한 B16F10 세포의 경우 4 일과 7 일에서 각각 50-60 %, 30-40 %로 감소함을 확인 하였다. 본 연구를 통하여 Dxt를 가용화하기 위해 SMES를 이용하였으며 이의 안정성 평가 및 항암효과를 확인 할 수 있었다. 약물전달체로 사용하기 위한 수분산계는 하이드로겔과 나노입자약물전달체로 나눌 수 있으며 본 연구에서는 신경계약물인 VA의 전달을 위하여 키토산 하이드로겔을 이용하였으며 VA의 전달 여부를 rMDSCs의 신경세포화를 통하여 확인 할 수 있었다. 또한 나노입자약물전달체인 SMES를 이용하여 난용성 항암제인 Dtx를 가용화 하였으며 높은 안정성과 항암효과를 가짐을 확인 할 수 있었다. 이로서 수분산계인 하이드로겔과 나노입자약물전달체는 앞으로 줄기세포 및 약물전달체로 사용이 가능함을 확인 할 수 있었다. ChapterⅠ. General introduction Ⅰ.1. Drug delivery system 2 Ⅰ.2. Water dispersion system 2 Ⅰ.2.1. Hydrogel 3 Ⅰ.2.2. Self-microemulsifying system 5 Ⅰ.3. Stem cells and neurogenesis 6 Ⅰ.4. Reference 7 Chapter Ⅱ. Neurogenesis of rat-Muscle Derived Stem Cells by Valproic acid in Thermo-sensitive Chitosan Hydrogel Ⅱ.1. Introduction 11 Ⅱ.2. Experimetal Section 13 Ⅱ.3. Results 20 Ⅱ.4. Conclusion 41 Ⅱ.5. Reference 42 Chapter Ⅲ. Preparation and Characterization of Self-Emulsified Docetaxel Ⅲ.1. Introduction 45 Ⅲ.2. Experimetal Section 46 Ⅲ.3. Results 51 Ⅲ.4. Conclusion 60 Ⅲ.5. Reference 61 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 줄기세포 및 약물 전달체로의 수분산계 개발 Gyeong Hae Kim Thesis 아주대학교 일반대학원 Gyeong Hae Kim 일반대학원 생물공학과 2011. 8 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000011819 약물전달 줄기세포