이광 이경아 2007-02 2107 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/7437 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2007. 2 인간 중간엽 줄기세포는 그것의 분화 가소성과 다양하게 이용 가능한 특성으로 인해 임상적인 치료제로 이용하기 위한 도구로써 효율성에 대하여 연구되어 왔다. 그러나 인간 중간엽 줄기세포의 성질과 신선도에 대해서는 아직 많이 알려지지 않았다. 본 연구에서는 시간의 경과에 따른 인간 중간엽 줄기세포의 생존 능력과 신선함에 대해 연구하기 위해서, 유전자 발현 정도에 따른 분류를 하기 위한 Microarray와 세포의 형태학적인 변화를 보기 위하여 transmission electronic microscope (TEM) 을 사용하였다. 유전자 발현 정도에 따라 분류하기 위해서 세포를 배양한 접시에서부터 얻어낸 세포를 시간 별로 둔 인간 중간엽 줄기세포로부터 얻어낸 total RNA를 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (2,949 functional genes) 을 이용하여 GeneChip 분석을 하였다. 시간이 지남에 따라 건강한 세포의 수는 줄어들었다. 약 50,000개의 유전자를 분석한 가운데 apoptosis와 stress에 관련되는 유전자의 변화가 two-fold 이상의 변화를 보인 것으로 나타났다. Apoptosis와 stress에 관련된 유전자의 발현 정도는 시간이 지날수록 상당히 증가하였고, 이것을 semiquantitative reverse transcription-PCR로 확인하였다. 형태학적인 변화를 보기 위해서는 trypan blue로 염색하여 세포의 생존능력을 평가하고 TEM으로 초미세구조의 형태변화를 보여주었다. 세포 생존능력은 시간이 지나면서 떨어지는 것을 볼 수 있었다. Control 그룹인 0 hr과 12 hr을 비교해보았을 때 0 hr에서 정상적인 membrane의 보전이 많았고 vacuole도 거의 없는 것으로 보여졌다. 배양 접시로부터 세포를 떼어낸 후 가능하면 빠른 시간 내에 인간 중간엽 줄기세포를 사용하는 것이 더 나을 것이다. 그러므로 시간은 줄기세포를 이용하는 직접적인 이식에 있어서 잠재적인 공급원으로써 인간 중간엽 줄기세포를 고려해보았을 때 시간은 필수적인 요소로 사료되었다. Ⅰ. Introduction = 1 Ⅱ. Materials and Methods = 5 Cell culture = 5 Trypan blue counting = 5 Flow cytometry = 6 Transmission electron microscopic observation = 6 Total RNA preparation and isolation = 7 Microarray procedure = 7 Microarray Data analysis = 8 Semiquantitative reverse transcription PCR assays = 8 Ⅲ. Results = 9 Cell viability = 9 Cell viability was detected by FACS = 9 Transmission electron microscopic photographs = 10 Microarray data analysis up and down regulation = 10 confirmation of gene expression by semiquantitative reverse transcriptase PCR = 11 Ⅳ. Discussion = 22 Ⅴ. Conclusion = 29 Ⅵ. References = 30 국문요약 = 35 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 시간 경과에 따른 인간 중간엽 줄기 세포의 유전자 발현 분석과 형태학적인 변화 관찰 Lee, Kyoung-A Thesis 아주대학교 일반대학원 Lee, Kyoung-A 일반대학원 분자과학기술학과 2007. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000002107 human bone marrow-derived mesenchymal stem cell Human mesenchymal stem cells(hMSCs) have been investigated for their efficacy as a clinical therapeutic tool as their differentiation plasticity and availability. However, the quality and the degree of freshness of hMSCs are not well known. In this study, to investigate the viability and freshness hMSCs over time, I used microarray for the gene expression profiling. I also used transmission electronic microscope for the observation of morphological changes. To evaluate the cell viability by time course, trypan blue count assay was performed on hMSCs. For the gene expression profiling, total RNA was extracted from hMSCs over time after cell dissociation from culture dish for GeneChip analysis using Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array(2,949 functional genes). The number of healthy cells was decreased over time. Among the about 50,000 genes assayed, relatively few of them showed two-fold changes of apoptosis, adherence relative, cell death signal, cytokine, growth factor, cell cycle, DNA repair, protein synthesis, development, differentiation and stress genes. The expression level of apoptosis and stress genes increased significantly over time, and confirmed with semiquantitative RT-PCR. Cell viability was slightly decreased by time dependent condition in PBS. However, transmission electronic microscope(TEM) results showed that more sparse intact membrane and more vacuole were observed in 12 hr time. Viable cells than that of 0 hr cells. It is better to use hMSCs very early after dissociation from culture dish. Therefore, time is essential factor when considering hMSCs using a potential source for stem cell-based direct transplantation.