신호준 송경희 2007-02 2020 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/7434 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2007. 2 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 흙과 연못, 담수 등에 존재하며 이러한 환경 속에 존재하는 세균을 먹고 살면서 인체와 실험동물에서 원발성 아메바성 수막뇌염 (primary amoebic meningoencephalitis)을 유발하는 병원성이 강한 자유생활 아메바이다. 파울러자유아메바의 병원성에 있어서의 열 충격 단백질 (heat shock protein 70)의 기능을 알아보기 위해, 보존적 Hsp70 유전자를 클로닝하였다. 유전자 클로닝은 비병원성인 그루버자유아메바 (Naegleria gluberi)의 열충격 단백질의 보존된 부분을 primer로 제작하여 시행 하였고, 결과로 2,062bp 길이의 유전자를 얻었다. 이 유전자는 Nf-cHsp70 이라 명명하였고 그 특성을 알아보기 위한 실험을 진행 하였다. 이 유전자와 다른 종들간의 상동성을 조사한 결과, 그루버자유아메바의 열 충격 단백질70과는 78%, 크루스파동편모충과는 67%, 사람 혹은 마우스와는 69%의 상동성을 보였다. 클로닝된 Hsp70 유전자를 E. coli에 형질도입으로 시켜 재조합 단백질을 얻었다. 이 재조합 단백질을 BALB/c 마우스 복강에 면역시켜 다클론 항체를 얻었고, 이 항체를 이용하여 파울러자유아메바 안에서 이 단백질의 위치를 확인한 결과 세포질 내에 분포하는 것을 관찰 할 수 있었다. 다양한 온도, pH 및 산화(oxidative) 스트레스를 파울러자유아메바에 준 후, Nf-cHsp70의 RNA, 단백질 상의 변화를 관찰한 결과 42℃온도 스트레스를 준 파울러자유아메바의 RNA와 단백질의 발현이 급격히 증가하는 것이 관찰되었고, 나머지 스트레스에는 크게 반응하지 안거나 감소하는 것으로 확인 되었다. 따라서 본 연구에서 클로닝한 Nf-cHsp70은 병원성 파울러자유아메바의 온도 내열성에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. Hsp70 단백질의 합성 기능을 알아보기 위해 Hsp70 단백질 합성의 유도를 억제하는 benzylidene lactam 계열의 물질인 KNK437를 처리 하여 실험한 결과 Nf-cHsp70의 발현이 억제제의 농도에 비례하여 억제됨을 관찰 하였고, 300 μM의 KNK437 처리 시 파울러자유아메바의 증식이 처리하지 않은 대조군에 비하여 약 79.4% 감소되었다. Hsp70 단백질의 발현이 억제 되었을 때, 파울러자유아메바의 표적 세포에 대한 세포독성에 변화가 있는지 알아보기 위해 51Cr 분비 실험한 결과, 표적 세포로 사용한 CHO 세포들에 대한 파울러자유아메바의 세포독성 실험은 KNK437을 처리한 파울러자유아메바에서 처리하지 않은 파울러자유아메바보다 세포독성이 43%-52%까지 감소된 것을 관찰 할 수 있었다. 따라서 파울러자유아메바의 Nf-cHsp70은 온도 저항성과 아메바 세포증식 그리고 병원성에 있어서 중요한 역할을 하는 유전자라고 생각된다. Ⅰ. INTRODUCTION = 1 Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 6 A. Amoeba and CHO cell culture = 6 B. Nucleic acid preparation = 6 C. Gene cloning = 7 D. Sequence analysis and homology alignment = 10 E. Recombinant Nf-cHsp70 expression and purification = 10 F. SDS - polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and immunoblotting = 11 G. Production of a polyclonal anti-Nf-cHsp70 antibody = 12 H. Immunofluoroscence assay = 12 I. Cross reactivity = 13 J. Semi-quantitative reverse transcription PCR = 13 K. Inhibition assay of Nf-Hsp70 = 14 1) Observation of viability of KNK437 treated N. fowleri = 15 2) Proliferation assay of KNK437 treated N. fowleri = 15 3) Chromium release assay = 15 Ⅲ. RESULT = 17 A. Cloning of Nf-cHsp70 gene = 17 B. Homology analysis of Nf-cHsp70 genes = 21 C. Characterization of recombinant protein (rHsp70) and polyclonal anti-cHsp70 antibody = 21 D. Cellular localization of the cHsp70 protein = 24 E. In vitro shock response of pathogenic N. fowleri to various stressors = 26 1) Temperature shock - induced changes in Hsp70 mRNA and Hsp70 protein levels = 26 2) Oxidative shock - induced changes in Hsp70 mRNA and Hsp70 protein levels = 26 3) pH shock - induced changes in Hsp70 mRNA and Hsp70 protein levels = 26 F. Functional study of Nf-cHsp70 by treatment of heat shock protein inhibitor = 30 1) Viability of N. fowleri treated with heat shock protein inhibitor KNK437 = 30 2) Inhibition of N. fowleri Hsp70 synthesis by KNK437 = 30 3) Proliferation of Hsp70 inhibited N. fowleri = 30 4) Recovery time of Nf-cHsp70 after treated with KNK437 = 34 5) In vitro cytotoxicity of N. fowleri trophozoites on CHO cell = 36 Ⅳ. DISCUSSION = 38 Ⅴ. CONCLUSION = 41 REFERENCES = 42 국문요약 = 50 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 병원성 파울러자유아메바로부터 열 충격 유전자의 클로닝 및 특성 분석 Song, Kyung-Hui Thesis 아주대학교 일반대학원 Song, Kyung-Hui 일반대학원 분자과학기술학과 2007. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000002020 Naegleria fowleri Hsp70 gene temperature tolerance PAME cell proliferation cytotoxicity Naegleria fowleri, a small free-living amoeba, has been isolated from samples obtained from that chlorinated swimming pools and freshwater lakes. It also exists as a virulent pathogen causing fatal primary amoebic meningoencephalitis (PAME) in experimental animal, humans and other mammals. N. fowleri is thermophilic, tolerating temperature of 35℃ - 45℃, but with N. fowleri contrast N. gruberi, a nonpathogenic, having an optimal growth temperature of 22℃ - 35℃. Members of Hsp70 gene family of molecular chaperones participate in a wide variety of cellular processes, including protein folding, translocation across membrane, refolding of denatured proteins, and lysosomal and ubiquitin-dependant degradation of cellular proteins. In this experiment, to evaluate the role of in growth and cytotoxicity of Hsp70 gene of N. fowleri, we cloned newly a constitutive Hsp 70 gene from pathogenic N. fowleri and observed their biochemical and immunological characters. First of all, we cloned heat shock 70 gene from pathogenic of N. fowleri. The full sequence of Hsp70 cDNA was 2,062 bp in length and contained an open reading frame (ORF) of 1,980 bp encoding a 660 amino acid protein with a deduced molecular weight of 71,407 Da, and named as Nf-cHsp70. Homology search demonstrated that the amino acid sequence of the Nf-cHsp70 gene is closely related to the cHsp70 gene from amoeba to mammals. The whole deduced amino acids sequences of the Nf-cHsp70 gene had 78% identity with Hsp70 of N. gruberi. The extent of homology of deduced amino acid sequence of the Nf-cHsp70 gene ranged from 67% with cytosolic Hsp70 gene of Trypanosome cruzi to 69% with Hsp70 gene of mouse or human. The ATP binding motif, known as active sites, showed 100% identity with all compared organisms. The Nf-cHsp70 was localized in the cytoplasm, pseudopodia, and phagocytic food-cups. The Nf-cHsp70 was gradiently induced at 27, 37 and 42℃ in a temperature - dependent manner. However, the change of expression level was not observed in N. fowleri treated by oxidative stress or pH change. A benzylidene lactam compound, KNK437, inhibited the induction of Hsp70 in a dose-dependant manner. After treatment with 300 μM of KNK437, the proliferation of N. fowleri was reduced by about 79.4% compared with untreated control. N. fowleri showed reduced cytotoxicity against CHO cells when its Hsp70 expression was inhibited by KNK437 treatment. My results suggest that cHsp70 plays an important role in high temperature tolerance, amoeba proliferation, and cytotoxicity of N. fowleri.