민병현 김민환 2007-02 1876 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/7430 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2007. 2 목적 : 본 연구에서는 중간엽 줄기세포를 연골로 분화시키는 과정 동안 신생혈관 형성에 대한 저강도 초음파의 효과에 대해 조사하였다. 저강도 초음파 자극을 전처리할 경우 중간엽 줄기세포의 연골조직으로의 분화를 촉진시키고 골 형성과정을 지연시킨다는 선행 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 그 기전을 관찰하고자 신생혈관형성작용에 관한 저강도 초음파의 효과를 알아보기로 하였다 실험 방법 및 재료 : 중간엽 줄기세포는 뉴질랜드 흰 토끼로부터 분리하여 단층배양을 하였다. 그 후 배양된 세포는 PGA 지지체(직경: 6mm 두께: 2mm)에 5 × 106씩 분주하여 체외에서 1주일간 배양하였다. 저강도 초음파 군의 초음파 처리는 200mW/cm2의 강도로 매일 15분, 하루 2번씩 1주일간 시행하였다. 1주일간 체외에서 저강도 초음파를 처리한 후 누드 마우스의 피하에 이식하여 1주, 2주, 4주 동안 배양한 뒤 조직학적, 면역형광 분석을 시행하였다. Safranin-O/Fast green의 조직학적 분석을 통하여 Glycosaminoglycan(GAG) 합성 정도를 확인하였으며 Von kossa 염색을 통하여 골 형성 정도를 비교 분석하였다. 연골 조직으로의 분화 정도 확인을 위해 RT-PCR 분석을 시행하였고, 혈관 내피세포에 대한 표지자를 이용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 신생혈관형성에 관련된 인자들에 대해서도 면역조직화학 염색을 시행하였다. 결과 : 본 연구에서는 조직학적 검사를 통해 저강도 초음파를 처리한 군에서 체내 배양 시 연골조직으로의 분화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 뼈로의 분화가 지연됨을 확인하였다. 혈관내피세포에 대한 표지자인 PECAM-1의 면역형광염색을 통하여 저강도 초음파를 처리한 군에서 혈관형성이 지연됨을 확인할 수 있었다. 체외 배양기간 동안 저강도 초음파 처리 시간에 따른 영향을 알아보기 위하여 1, 3, 5, 7일 시료를 채취하여 RT-PCR, 면역조직화학염색을 시행하였다. 저강도 초음파를 처리한 군에서 제 2형 교원질 알파 1(Type II collagen alpha 1) 유전자의 발현증가와 MMP-1 유전자의 감소, TIMP-1, TIMP-2 유전자의 발현증가를 통해 연골로의 분화가 촉진됨을 확인할 수 있었으며 HIF-1α, VEGF-A에 대한 면역화학조직염색을 통하여 저강도 초음파를 처리한 군에서 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 결론 : 본 연구를 통해 중간엽 줄기세포의 연골분화 과정 동안 저강도 초음파를 처리하면 연골분화를 촉진하며 골분화가 지연되고 신생혈관 형성에 관여하는 인자들의 발현 또한 억제됨을 확인 할 수 있었다. Ⅰ. 서론 = 7 Ⅱ. 실험 재료 및 방법 = 14 1. 세포 분리 및 배양 = 14 1)중간엽 줄기 세포의 분리 및 배양 = 14 2)연골 세포의 분리 및 배양 = 14 2. 생체 외 배양 = 15 3. 저강도 초음파 자극 = 15 4. 동물 이식 = 18 5. 조직학적 검사 = 18 6. 면역형광 검사 = 19 7. 면역조직화학적 검사 = 20 8. RT-PCR = 20 Ⅲ. 결과 = 22 A. 체내 배양 결과 = 22 1. 육안적 소견 = 22 2. 조직학적 검사 = 22 3. 면역형광 검사 = 22 B. 체외 배양 결과 = 27 1.중간엽 줄기세포의 배양과 PGA 지지체 접종 = 27 2.육안적 소견 = 27 3. 조직학적 검사 = 27 4. RT-PCR = 30 5. 면역조직화학적 검사 = 30 Ⅳ. 고찰 = 33 Ⅴ. 결론 = 36 참고문헌 = 37 영문요약 = 40 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 저강도 초음파 자극이 중간엽 줄기세포의 연골분화 과정 동안 신생혈관형성에 미치는 영향 Kim, Min-Hwan Thesis 아주대학교 일반대학원 Kim, Min-Hwan 일반대학원 분자과학기술학과 2007. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000001876 저강도 초음파 연골분화 신생혈관형성 중간엽 줄기세포 Purpose In our previous study, Low-intensity ultrasound(LIUS) stimulated the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells embedded in polyglycolic acid(PGA) in vivo condition and osteogenic differentiation of the cells was inhibited. In the present study, we hypothesized that the LIUS pretreatment might inhibit angiogenesis and in turn delay the osteogenic process during the chondrogenic differentiation of MSCs. The effect of LIUS was investigated on the expression of osteogenic phenotypes, blood vessel invasion, and expression of angiogenic markers. Material & Method MSCs and chondrocytes were isolated from the bone marrow and articular cartilage of the knee, respectively, of New Zealand white rabbits and cultured in monolayer for 2 weeks. They were then harvested and seeded into polyglycolic acid (PGA) scaffold(5ⅹ106 cell/scaffold). The MSC-seeded PGA scaffolds were first cultured in vitro in chondrogenic-defined media with the LIUS stimulation at a frequency of 0.8 MHz and an intensity of 200Mw/cm2 for 15 min/12h for 1 week, Then they were implanted subcutaneously in the dorsum of nude mice and maintained for another 4 weeks without further LIUS stimulation. Result We confirmed the stimulation of the chondrogenic differentiation and inhibition of osteogenic differentiation of LIUS-pretereated MSC embedded PGA scaffolds in vivo study. Non-treated MSC embedded PGA scaffold more rapidly progressed the osteogenic differentiation and the vessel invasion was observed by detection of PECAM-1 at 2weeks of in vivo culture. Thus, the LIUS effect during in vitro culture of MSC embedded PGA scaffold was investigated by RT-PCR and immunohistochemistry. The expressions of HIF-1α and VEGF-A proteins were inhibited by LIUS-pretreatment. This indicates that the vessel invasion process was already suppressed by LIUS-pretreament of MSC-seeded PGA scaffold in vitro before in vivo implantation. In the RT-PCR analysis, LIUS pretreatment increased the expression of tissue inhibitor of matrix metelloproteae-1 (TIMP-1) and Collagen type II alpha1(ColIIα1) genes at 1 day in vitro. In contrast, the level of matrix metalloprotease-1(MMP-1)genes was decreased at 7 days in vitro. Conclusion This study demonstrated that LIUS pretreatment of MSC-seeded PGA constructs promoted chondrogenesis of MSCs, as well as, LIUS pretreatment was effective to delay osteogenic differentiation, inhibiting vessel invasion during the chondrogenesis of MSCs in vivo. The precise role of LIUS pretreatment during chondrogenic differentiation of MSCs in vivo condition will be elucidated in future work. key words: Low intensity ultrasound, chondrogenesis, angiogenesis, Mesenchymal stem cells.