윤계순 김이령 2007-02 2149 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/7429 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2007. 2 대부분의 암세포는 미토콘드리아 기능이 손상되어 있으며 해당과정에서 생성된 ATP에 의존적으로 성장한다는 사실은 오랫동안 알려져 왔다. 그러나 암세포가 가지고 있는 해당과정 활성이 암세포의 전이활성에 어떠한 영향을 주는지에 대해서는 구체적으로 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 6 종류의 사람 간암 세포주 (SNU cells)를 이용하여 암세포의 해당과정 활성화 전이활성중의 한 요소인 세포이동활성과의 상관관계를 밝히고자 하였다. 정상 간세포주인 Chang세포와 비교하였을 때, SNU387을 제외한 나머지 5개의 세포주 (SNU354, SNU398, SNU423, SNU449, SNU475)에서 해당과정 활성이 높게 나타나는 것을 확인하였다. 이 세포주에서는 lactate dehydrogenase (LDH) H 단백질 발현이 저하되어 있어 사량체 (4개의 단백질)로 구성된 LDH isozyme이 LDH5로 전환되어 있는 것이 해당과정 활성화의 하나의 원인임을 알 수 있었다. 또한 이러한 해당과정의 활성화로 인해 세포 배양액으로 lactate의 생성 및 배출이 증가하여 배양액의 pH가 낮아지는 것을 확인하였다. 더욱이 해당과정 활성이 높은 SNU 세포주에서는 미토콘드리아 호흡사슬 연관 단백질의 발현 정도가 더 낮게 발현되어 있음을 보아 해당과정의 활성화와 미토콘드리아의 기능손상이 서로 밀접한 상관관계가 있음을 제시하였다. 흥미로운 것은 해당과정 활성이 높게 나타난 SNU 세포주에서 SNU398을 제외하고는 세포이동활성이 높은 것으로 확인되었다. 이러한 세포이동활성이 해당과정 활성화 또는 미토콘드리아 기능손상과 직접적으로 연관되어 있는지를 확인한 결과, 5~10 mM lactate 또는 9 mM HCl을 처리하여 해당과정 활성화에 의한 세포환경변화를 유도하거나, 5 mM KCN을 처리하여 미토콘드리아의 기능을 손상시키거나, 또는 LDH H siRNA를 이용하여 LDH 활성조절로 해당과정 활성화를 유도시켰을 때, 세포의 이동활성이 모두 증가되는 것을 확인하였다. 본 연구는 암세포에서 미토콘드리아의 기능손상이 세포의 이동활성에 밀접하게 영향을 줄 수 있음이 확인되었고, 해당과정의 활성화가 세포 이동활성에 직접적으로 관여함이 확인되었다. 이 결과는 암세포가 가지고 있는 해당과정 활성화가 미토콘드리아 기능 손상과 연관이 있으며, 세포 이동활성을 증가시킴으로써 악성종양으로 진행하는 과정에 깊이 관여할 수 있음을 암시한다. Ⅰ. 서론 = 1 Ⅱ. 재료 및 방법 = 5 A. 세포주 배양 = 5 B. 세포성장률 측정 = 5 C. Western blot analysis = 5 D. 세포 밖 배양액의 pH 측정과 Lactate assay = 6 E. 세포 이동 활성 = 8 F. Subcloning of pIRES2-LDH H = 9 Ⅲ. 결과 = 10 A. SNU간암세포주에서 호흡사슬 연관 단백질의 발현도 확인 = 10 B. 미토콘드리아의 기능이 손상된 암세포주의 세포성장률 저하 확인 = 10 C. 미토콘드리아의 기능손상과 대사전환과의 연관성 확인 = 11 D. 세포 밖으로 방출된 lactate의 양 측정 = 11 E. 세포 밖의 pH 측정 = 12 F. 세포 내의 pH 조절 단백질의 발현 확인 = 12 G. Chang세포와 SNU간암세포주의 세포이동능력 확인 = 13 H. LDH H 단백질의 발현과 세포이동능력과의 연관성 확인 = 14 I. 해당과정 활성과 미토콘드리아 기능손상에 의한 세포이동능력 효과 확인 = 14 Ⅳ. 고찰 = 33 Ⅴ. 결론 = 37 Ⅵ. 참고문헌 = 38 Abstract = 42 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 간암세포에서 LDH5와 세포이동과의 상관관계 연구 Kim, Ei-Lyoung Thesis 아주대학교 일반대학원 Kim, Ei-Lyoung 일반대학원 분자과학기술학과 2007. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000002149 미토콘드리아 기능손상 Mitochondrial dysfunction of cancer cells and their dependence on glycolytic ATP production have long been implicated in carcinogenesis. However, it is not clear how glycolytic activation affects invasiveness of cancer cells. In this study, we elucidated relationship between glycolytic activation and migration activities of cancer cells by employing 6 different SNU human hepatoma cell lines. We could select SNU cells (SNU 354, 398, 423, 449, 475) having higher glycolytic activity by monitoring lactate dehydrogenase (LDH) isozyme, expression of LDH H proteins, lactate production into media, and media pH, indicating that activation of glycolysis was modulated by transition of LDH isozyme to LDH5 via decreased LDH H expression and then lowered media pH through lactate overproduction. Interestingly, expression levels of mitochondrial respiratory proteins in the SNU cells with activated glycolysis were repressed, implying close relationship between glycolytic activation and mitochondrial dysfunction. Furthermore, the SNU cells with higher glycolytic activity displayed higher migration activity except SNU 398. We also found that 5-10 mM lactate, 9 mM HCl, 5 mM KCN, and LDH H siRNA increased cell migration activity. These results implied that there might be substantial correlation between the mitochondrial defects and cellular migration of cancer cells and that the activated glycolysis accompanied by mitochondrial dysfunction might play an important role in acquiring migration activity during carcinogenesis, thereby contributing to metastastic power of the cancer cells.