이명애 김수민 2006-02 1205 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/7403 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :학과간협동과정,2006. 2 사람 신경줄기세포주는 다능성과 자가소생능을 가지고 있기 때문에 인간의 발달생물학에 매우 유익한 실험적 도구 구실을 할 수 있고 세포대체치료법에 무한한 세포자원을 제공할 수 있다. 성체 중추신경계에서 신경발달과정과 신경줄기세포 생물학은 중추신경계 회복에 미래의 치료적 적용과 중추신경계의 기초적인 기능 둘 다에 관해서 중요하다. 파킨슨 병은 중뇌 도파민 신경세포가 일차적으로 손실되고 Nurr1이 제거된 쥐는 이때 중뇌 도파민 신경세포가 부족하고 태어나자마자 죽게 되므로 Nurr1이 중뇌 도파민 신경세포의 발달과 분화에 필수적이라는 것을 제시한다. 비록 Nurr1은 전사인자로서의 기능을 할 것으로 여겨지지만 도파민 신경세포합성과정에 관련된 downstream targets은 거의 밝혀지지 않았다. 도파민 신경세포 합성과정에서 있음직한 분자적인 일련의 단계적 과정을 연구하기 위해서, 우리는 사람 신경줄기세포주와 Nurr1-과발현 사람신경줄기세포주의 gene-expression profile을 Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 arrays를 사용해서 비교해보았다. Nurr1-과발현 세포주에서 약 290가지의 유전자가 up 또는 down-regulation 되었고 또한 그 중에서 189가지의 유전자들은 promoter부위에 Nurr1-binding site를 가지고 있었다. 그러나, 오직 29가지의 유전자들만이 세가지 세포주에서 공통적으로 조절되는 것을 알 수 있었다. Microarray 결과의 타당성을 검증하기 위해서 Pleiotrophin, Neuromedin U, Calponin1 등을 포함하는 up-regulation된 유전자와 G0S2, Galanin을 포함하는 down-regulation된 선별된 12가지의 선별된 유전자들을 quantitative real-time RT-PCR을 수행하였다. Real-time PCR에 의해 관찰된 발현패턴은 microarray에 의해서 분석된 패턴과 대다수 일치했다. 이러한 검사에서 동정된 유전자들이 Nurr1의 직접적인 target들인지 확인하기 위해서 우리는 CNN1과 PRC1 promoter로 luciferase reporter gene analysis를 수행하였다. 이번 연구에서 우리가 동정한 Nurr1에 의해서 조절된 유전자군은 도파민 신경세포합성과정에서 중요한 역할을 할 것이다. 게다가, 중추 도파민성 신경세포의 발달을 조절하는 유전자군의 동정은 중뇌 도파민 신경세포 생합성과정과 파킨슨 병에서 도파민성 신경세포 사멸의 인과관계에 이르는 분자적인 메커니즘으로의 새로운 견식을 제공할 것이다. ABSTRACT……………………………………………………………………………… 5 TABLE OF CONTENTS ………………………………………………………………… 7 LIST OF FIGURES ………………………………………………………………………. 9 I. INTRODUCTION ……………………………………………………………………… 10 II. MATERIAL AND METHODS ...………………………………………………………12 1. Human neural stem cell cultures……………………………………………………… 12 2. Retrovirus-mediated gene transfer…………………………………………………….12 3. Northern blot analysis…………………………………………………………………13 4. RT-PCR………………………………………………………………………………….13 5. Microarray…………………………………………………………………………….13 A. Sample preparation……………………………………………………………..13 B. Hybridization, Washing, and Scanning………………………………………14 C. Analysis……………………………………………………………………….15 6. Quantitative, real-time PCR …………………………………………………………16 7. Cloning of the 5'-Flanking Region of the Human CNN1 and PRC1 Genes by PCR Amplification Method.......................................................................................................17 8. Transfection and Luciferase assays …………………..........……………………………18 III. RESULTS………………………………………………………………………………19 1. Characterization of human Neural Stem Cells……………………………………….19 2. Manufacture of Nurr1-overexpressing cell lines……………………………………19 3. Identification of Significantly Nurr1 gene targets……………………………………19 4. Verification of the Results by Semi-quantitative real-time RT-PCR Assay…………….22 5. Validation of direct Nurr1 target genes…………………………………………………22 IV. DISCUSSTION………………………………………………………………………….24 V. REFERENCES…………………………………………………………………………42 국문요약…………………………………………………………………………………….50 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 사람신경줄기세포에서 전사인자 Nurr1에 발현이 조절되는 유전자군의 탐색 Kim Soo Min Thesis 아주대학교 일반대학원 Kim Soo Min 일반대학원 학과간협동과정 2006. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000001205 Nurr1 Human neural stem cells, due to their capacity of multipotency and self-renewal, may serve as a valuable experimental tool for human developmental biology and may provide an unlimited cell source for cell replacement therapy. Especially, neurogenesis and neural precursor/stem cell biology in adult CNS are important both toward potential future therapeutic applications for CNS repair, and regarding the fundamental function of the CNS. In Parkinson’s disease, midbrain dopaminergic neuron primarily lost and Nurr1-null mice are born lethal, lacking the midbrain dopamine (DA) neurons, suggesting that Nurr1 is essential for the development and differentiation of midbrain DA neurons. Although Nurr1 is thought to function as a transcription factor, few downstream targets that were concerned in dopaminergic neurogenesis have been identified. To investigate possible molecular cascades in dopaminergic neurogenesis, we compared the gene-expression profiles of human NSC lines and Nurr1-overexpressing human NSC lines using Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 arrays. About 260 genes were up or down-regulated in each Nurr1-overexpressing cells. Also, Among them, 189 genes have Nurr1-binding site in their promoter. However, Only 29 genes were found to be up- or down-regulated by Nurr1 in all 3 Nurr1-overexpressing cells. To determine the validity of results obtained by the microarray analysis, twelve selected genes that are upregulated including Pleiotrophin, Neuromedin U, Calponin1, etc. and are downregulated including G0S2, Galanin were subjected to semi-quantitative real-time RT-PCR analysis. These expression pattern observed by real-time RT-PCR showed a good concordance with the pattern analyzed by microarray. To confirm if genes identified in this survey are direct targets of Nurr1, we were performed luciferase reporter gene analysis of the CNN1 and PRC1 promoters. Genes regulated by Nurr1 that we identified in this study may play essential roles in dopaminergic neurogenesis. In addition, identification of genes controlling the development of central DA neurons may provide new insight into the molecular mechanisms leading to midbrain DA neurogenesis and the etiology of DA neuronal cell deaths in PD. . Keywords: Nurr1, Dopaminergic neurons, Microarray, Human neural stem cell