유연우 정은영 2009-02 9561 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/7257 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2009. 2 Avermectins은 Streptomyces avermitilis에서 유일하게 생산되는 이차대사산물로서 광범위한 구충효과를 가지고 있다. Avermectins은 구조적으로 유사한 8개의 유도체로 생합성 되며, 이들 중 B1a가 가장 효과적이고 광범위하게 구충효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 S. avermitilis로부터 avermectin B1a의 생산을 증가시키기 위한 실험을 수행하였다. 사용한 균주로는 NTG를 이용한 random mutation을 통하여 개발된 avermectin B1a의 고생산 변이주(AJ-7)를 사용하였다. 먼저 AJ-7의 배양 특성 (cell growth curve, pH, 당농도 변화)과 이차대사산물 생산 특징을 flask 배양을 통해 알아보았다. 그 결과 세포의 성장은 배양 8일까지 지속되어 8일 배양시에 가장 높은 세포 농도를 나타내었으며, 당은 배양 7일에 모두 소모되었다. Avermectin B1a의 생성은 배양 2일부터 시작되어 배양 7일째 가장 높은 양으로 생산되었다. 또한 avermectin B1a 생합성과 관련된 다양한 물질들을 첨가하여 B1a 생산을 증가시키고자 하였다. Vitamin의 일종인 biotin과 avermectins의 전구체가 되는 L-isoleucine, major methyl donor로 작용하는 S-adenosylmethionine (SAM)을 각각 3.0 ㎍/ml, 0.5 g/L, 0.1 mM 농도로 첨가하였을 때, 첨가하지 않은 것보다 각각 1.2배, 1.7배, 5.6배 avermectin B1a의 생산이 증가되었다. 반면에 한국 바스프사에서 vitamin B2를 생산한 후에 decantation으로 얻은 상등액인 BASF sample을 유기 질소원으로 사용하였을 때는 오히려 avermectin B1a 생산이 1/10 수준으로 감소하였다. Avermectin B1a 생산을 증가시키기 위한 다른 방법으로 발효조 배양을 수행하였다. 배양 조건의 최적화를 위해서 교반 속도와 통기 조건을 다양하게 변화시켜 실험한 결과, 700 rpm, 0.8 vvm 조건에서 세포농도는 flask 배양에서와 비슷하였으나, avermectin B1a의 생산은 약 372.5 mg/L 로서 flask 배양보다 1.7배 증가하였다. 본 연구를 통해 avermectin B1a 생산 증가에 효과적인 물질과 첨가량을 확인하여 실험실 규모의 배지 최적화에 기여하였다. 또한 AJ-7의 발효조 회분식 배양에 의한 avermectin B1a 생산성 및 생산비의 향상 결과는 배양 규모의 확대 시 유용하게 적용될 수 있으며, 이는 avermectins의 산업적 생산에 있어 경제성을 크게 높일 수 있을 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 본 연구진에서 개발한 avermectin B1a 고생산성 균주인 AJ-7 의 배양 특성을 확립함으로써 이후 AJ-7을 이용한 연구를 계속적으로 수행하는데 필요한 기초 자료를 마련하였다. List of Figures Ⅲ List of Tables Ⅴ 국문 요약 Ⅵ Ⅰ. 서 론 1 1. 연구 배경 1 1-1. 방선균 1 1-2. Streptomyces avermitilis 4 2. 연구 개발의 목적 및 중요성 5 2-1. Avermectin의 특성과 중요성. 5 2-2. 최적 배양 조건 확립의 중요성 8 2-3. 연구 목적 9 Ⅱ. 재료 및 방법 10 1. 실험 재료 10 1-1. 균주 10 1-2. 배양 배지 11 1-3. 항생제 및 시약 14 2. 실험 방법 15 2-1. S. avermitilis AJ-7의 배양 15 2-2. Biotin 영향 15 2-3. 전구체 영향 16 2-4. S-adenosylmethionin(SAM) 영향 16 2-5. BASF sample 영향 20 2-6. 교반 조건의 최적화 20 2-7. 통기 조건의 최적화 21 3. 분석 방법 22 3-1. Avermectin 추출 22 3-2. 건조 균체량 22 3-3. Avermectin 정량 분석 (HPLC) 23 3-4. Avermectin 정성 분석 (LC/MS) 23 3-5. 당분석 25 Ⅲ. 결과 및 고찰 27 1. S. avermitilis AJ-7의 배양 특성 27 2. Avermectin의 정성 분석 31 3. Biotin 영향 39 4. 전구체 영향 42 5. S-adenosylmethionin(SAM) 영향 47 6. BASF sample 영향 51 7. 교반 조건의 최적화 55 8. 통기 조건의 최적화. 60 9. 회분식 배양. 64 Ⅳ. 결 론 67 Ⅴ. 참고 문헌 69 Abstract 75 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Streptomyces avermitilis AJ-7로부터 Avermectins의 생산에 대한 연구 Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 분자과학기술학과 2009. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000009561 Streptomyces avermitilis Avermectin