조혜성 김조선 2010-02 10508 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/6426 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2010. 2 Chfr은 stress checkpoint 단백질로써 세포주기의 진행과 암 억제에 중요한 역할을 하며 유사분열의 주요 인산화 단백질인 Aurora A, Plk1의 발현양을 조절함으로써 염색체의 안정성 유지에 관여한다. Chfr의 기능 상실이 암 발생 과정에서 중요하게 작용하고 있을 가능성에도 불구하고 Chfr의 정확한 기능과 작용 기전은 알려진 바가 매우 적으며, checkpoint 로써 작용함에 있어서도 Chfr에 의한 염색체 응축 지연 현상에 대한 분자생물학적 메커니즘은 여전히 불분명하다. 본 연구에서는 다양한 세포주에 Chfr을 이입하고 nocodazole과 같은 microtubule poison에 세포를 노출시켰을 때 microtubule stress에 반응하는 유사분열 초기 checkpoint의 주요 조절자인 Chfr의 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰하였다. 이에 기인하여 Chfr의 발현변화와 Chfr의 기능 사이에 어떤 연관성이 있는지를 관찰하고, 세포 내의 Chfr의 발현변화가 정상적인 세포주기의 진행과 Chfr에 의한 유사분열 지연 기전에 어떤 역할을 하고 있는지 그 세부 기전을 밝히고자 하였다. Nocodazole과 같은 microtubule poison을 시간대 별로 처리하고 각각 유사분열과 G2기의 세포를 수확하여 관찰한 결과, 유사분열에 들어간 세포에서는 점진적으로 Chfr의 발현이 감소하는 반면 Chfr에 의한 checkpoint가 활성화 되어 있을 것이라 예상되는 G2기의 세포에서는 Chfr의 발현이 높게 유지되고 있는 것을 관찰하였다. 다음으로 세포주기의 진행 동안 G1/S기에 높게 발현하다 G2 후반기 이후로 유의하게 감소하는 세포주기에 따른 Chfr의 발현 변화를 관찰하였다. 이러한 세포주기 동안의 Chfr의 발현감소는 auto-ubiquitination에 의한 것임을 ubiquitin ligase활성을 제거해 준 돌연변이(ΔRF-Chfr, I306A-Chfr)를 이용한 실험에서 확인하였다. 세포 주기에 따른 Chfr의 발현변화가 정상적인 세포주기의 진행에 요구되는 사항인지를 밝히기 위해 기질에 대한 ubiquitin ligase 활성은 그대로 가지되 auto-ubiquitination의 표적이 될 가능성을 가진 lysine(K)을 alanine(A)으로 치환하여 발현 감소가 저해된 돌연변이를 제작하였다. Lys(K)돌연변이를 이용하여 G2/M 기 동안 Chfr의 지속적인 과발현을 유도하였을 경우 G2기의 지연 현상이 유도됨을 관찰하였다. 본 연구의 결과를 통해 세포주기의 진행 중 G2/M 전이 조절에 Chfr의 발현 변화가 중요한 조절자로 작용하고 있으며, microtubule stress 하에서 Chfr의 발현변화는 Chfr에 의한 전이지연기전에서 checkpoint 활성을 on/off 시킬 수 있는 switch와 같은 역할을 하고 있음을 밝히고 있다. 차례 국문요약 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• i차 례 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• iii그림차례 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• v Ⅰ. 서론 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1 Ⅱ. 재료 및 방법 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6 A. Cell culture •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6 B. Reagent and antibody ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6 C. Cell synchronization ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 D. Plasmid constructions and point mutation •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7 E. Flow cytometry for DNA contents and mitotic index counting ••••••••••••••••••• 8 F.Transfection and Immunoblot analysis•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9 G. Immunofluorescence staining and confocal microscopy •••••••••••••••••••••••••• 10 H. Cyclin B1-associated Cdk1 kinase activity assay ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10 Ⅲ. 결과 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12 A. Microtubule targeting drug처리한 세포주에서 Chfr의 발현 증가 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12 B. Nocodazloe 처리 후 G2기와 유사분열에서 Chfr의 발현 •••••••••••••••••••••••••••••• 12 C. 세포주기 동안 Chfr의 발현 변화 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14 D. 세포주기 동안 Auto-ubiquitination에 의한 Chfr 의 발현감소 ••••••••••••••••••15 E. Auto-ubiquitination에 의한 발현 감소가 억제되는 Lys(K)-뮤턴트제작 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16 F. Chfr 과 뮤턴트의 세포 내 위치 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17 G. Late G2, M 시기 동안 Chfr lysine 뮤턴트(K2A-Chfr)의 발현증가 ••••••• 18 H. Late G2, M기 동안 Chfr 발현이 증가된 세포에서 G2/M 전이 장애 ••••••••••• 20 I. G2/M기 동안 K2A-Chfr에 의해 지연된 CylinB1/Cdk1 kinase 활성 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.22 Ⅳ. 고찰 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 42 Ⅴ. 결론 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 47 Ⅵ. 참고문헌 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 48 영문요약 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 53 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 세포주기에 따른 Chfr(Checkpoint with FHA and RING domains)의 발현변화와 G2/M 전이 조절 Cell Cycle Dependent Degradation of Chfr (Checkpoint with FHA and RING domains) Modulates G2/M Transition Thesis 아주대학교 일반대학원 Jo-Sun Kim 일반대학원 분자과학기술학과 2010. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000010508 Early mitotic checkpoint Chfr E3 Ub ligase G2/M transition 세포주기 Checkpoint with FHA RING domains