이종수 조현석 2009-08 10186 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/6418 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2009. 8 생체 내에서 번역이후 변형화 (post-translational modifications)는 단백질의 활성 및 기능조절, 단백질의 턴오버 (turnover), 단백질의 지역화 및 단백질들 간의 상호 작용에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 그 예로 단백질의 아세틸화 (Acethylation), 메틸화(Methylation), 유비퀴틴화(Ubiqutination), 인산화 (Phosphorylation), 글라이코실화 (Glycosylation)등을 통해서 단백질의 활성 및 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. 최근 단백질의 수모화 (SUMOylation)에 의한 단백질 기능 변화와 조절기전에 관한 수많은 연구가 진행됨에 따라 여러 종류의 수모 단백질들(Ubls, small ubiquitin-like proteins)이 밝혀졌다. Ubc9은 수모화 일으키는 3단계의 경로 중 두 번째 단계에 관여하여 수모 결합을 담당하는 유일한 효소로서 (SUMO conjugation enzyme), 수모의 C-말단과 thiol ester 결합을 형성한 후 표적단백질의 라이신 잔기에 수모를 전달하여 conjugation 과정을 완성한다. Ubc9은 표적단백질을 선택하는 과정에서도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Ubc9은 표적단백질에 존재하는 수모화에 관여하는 보존 아미노산 서열 (ΨKXE)을 인지하여 수모화-E3 ligase들과 함께 표적단백질들을 선별하는 기능이 있다. 본 연구는 효모 교잡법을 통해서 Ubc9과 상호 작용하는 단백질을 발굴하고 이 상호작용의 기능을 밝히고자, 새로운 수모화 단백질을 동정하고 수모화에 의한 표적 단백질의 기능조절 기전을 규명하는 연구를 하였다. Ubc9을 bait로 이용한 효모 교잡법 실험을 통하여 CHD3 (Chromodomain Helicase DNA binding protein 3)이 Ubc9과 상호결합 하고 수모화 될 수 있음을 밝혔다. Ubc9은 CHD3의 C-말단의 부분 (1720aa-2000aa)과 상호 작용하였으며, 동물세포에서 두 단백질의 상호 작용을 동시면역 침강법으로 관찰 하였다. 더불어 두 단백질이 세포내에서 UV 조사시 핵에 지역화 되며 공존하는 것을 면역 형광 현미경으로 관찰하였다. 따라서 본 연구를 통하여, CHD3가 Ubc9과 상호작용하고 CHD3가 수모화 된다는 사실을 밝혀내었다. 목 차 국문 요약 1 목 차 2 List of Figures 4 List of Tables 5 I. 서 론 6 II. 실험 재료 및 실험방법 1. 서브클로닝 9 2. 효모(AH109) 형질 전환과 효모 교잡법을 이용한 단백질들의 스크리닝 (1) 효모(AH109) 형질 전환 9 (2) Bait의 자활 전사 능력(Self activation) 분석 10 (3) 효모 교잡법을 이용한 상호 작용하는 단백질들의 스크리닝. 10 (4) Small scale mating 방법과 X-α-Galactoxidase 이용한 두 단백질들 간의 상호 작용 재확인 11 3. 단백질 발현 확인 11 4. 세포 배양 및 트랜스펙션 12 5. 면역 침강법(Immunoprecipitation) 12 6. 면역 형광 분석(Immunofluorscence assay) 12 III. 결 과 1. Ubc9과 상호작용하는 단백질들 (1) 효모 교잡법으로 확보한 콜로니들 13 (2) PCR 생성물 13 (3) 염기서열 분석을 통한 상호작용 단백질 정의 13 2. Ubc9과 상호작용하는 CHD3 (1) CHD3의 상호 작용 부분과 CHD3 구조도 14 (2) 효모에서 Ubc9과 CHD3의 상호작용 여부 재확인 14 (3) 인간 세포내에서 Ubc9과 CHD3의 상호작용 여부 확인 14 (4) 면역 형광현미경을 이용한 Ubc9과 CHD3의 지역화 확인 14 IV. 결론 및 고찰 22 V. 참고 문헌 24 Abstract 30 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 효모 교잡법을 이용한 Ubc9의 상호작용 단백질의 동정 및 기능연구 Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 분자과학기술학과 2009. 8 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000010186 효모 교잡법 Ubc9 상호작용 단백질 동정 기능연구