유연우 윤상영 2007-02 1879 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/5734 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2007.2 Metagenome pool로부터 열 안정성을 가지며 (S)-ketoprofen ethyl ester를 광학 분할하는 (R)-form에 비해 (S)-form의 ketoprofen을 많이 생성하는esterase colony 들을 찾았다. 이러한 활성을 보이는 colony 에서 fosmid로부터 얻은 20-30 kb의 insert를 여러 제한 효소로 잘라서 그 활성을 측정하였다. 이에 따라 최종적으로 DNA sequence size가 1170 bp, 단백질 크기가 약42.8 KDa의 esterase (EST-Y29) gene을 찾을 수 있었다. 그리고 찾은 EST-Y29 sequence는 Gene Bank의 DNA Blast 결과 기존의 알려진 esterase와 상동성이 30 % 미만인 새로운 esterase임을 확인하였다. EST-Y29의 최적 pH는 7.0 (phosphate buffer)이며, pH 6.0 (phosphate buffer)이상 에서는 안정함을 보이지만, pH 6.0이하로 갈수록 불안정 해지는 현상을 보였다. EST-Y29의 최적 온도는 65 ℃인 것으로 나타났고, 온도가 낮을수록 (S)-ketoprofen 순수도인 eep (%)는 약99% 까지 높아지는 현상을 보였다. 그리고 EST-Y29의 size를 SDS-PAGE로써 확인해본 결과 약42.8 KDa의 크기로 확인이 되었다. 하지만, EST-Y29 의 native size를 size-exclusion HPLC로 측정해 본 결과 약 8개의 monomer가 합쳐진 형태인oligomer를 형성하는 것으로 보였다. 이러한 구조는 esterase의 열 안정성을 60 ℃까지 높이는 역할을 한 것으로 보인다. Ⅰ. 서론 = 1 1.연구 배경 = 1 2. Literature review = 4 2.1 Ketoprofen 정의 및 시장 동향 = 4 2.2 Esterase의 정의 및 역할 = 6 2.3 Metagenome 의 정의 = 8 3. 본 실험실에서 연구되었던 esterase들의 비교 = 9 4. 실험 목적 = 10 Ⅱ. 재료 및 방법 = 11 1. Metagenome pool에서 Fosmid의 분양 = 11 2. 1-naphtyl acetate 와 Fast Blue B Salt를 이용한 activity staining = 12 3. Ketoprofen 배지에서의 esterase positive colony의 선별 = 13 4. Ketoprofen 을 가수 분해하는 Esterase positive colony에서 Fosmid의 분리 = 14 5. 열 안정성이 높은 Esterase ORF gene의 Cloning = 15 6. 재조합 esterase의 정제 = 17 7. SDS PAGE = 18 8. Native PAGE = 19 9. p-nitrophenyl 유도체들을 이용한 esterase의 활성 측정 = 20 10. Ketoprofen ethyl ester를 이용한 esterase의 활성 측정 = 21 11. 효소의 최적 pH 및 pH 안정성 측정 = 23 12. 효소의 최적 온도 및 열 안정성 측정 = 24 13. 유기 용매와 계면활성제의 효소에 대한 영향 측정 = 25 Ⅲ. 결과 = 26 1. Metagenome pool에서 Esterase Positive Colony Selection = 26 2. Ketoprofen 배지에서의 esterase positive colony의 선별 및 HPLC로써 확인 = 29 3. Esterase ORF gene의 Cloning. = 32 4. Clone된 Esterase ORF gene의 Sequencing 및 Expression Vector에 subcloning = 37 5. Esterase의 Size의 측정 = 41 6. p-nitrophenyl 유도체들을 이용한 esterase의 활성 측정 = 46 7. Esterase의 최적 온도 및 열 안정성 측정 = 48 8. 최적 pH및 pH 안정성 = 52 9. 유기용매 및 계면활성제의 영향 = 55 10. 기질 농도에 따른 Esterase 활성 측정 = 60 Ⅳ. 결론 = 62 Ⅴ. Reference = 64 Abstract = 67 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 메타게놈 라이브러리로부터 새로운 octameric esterase의 클로닝과 특성 Yoon, Sang-Young Thesis 아주대학교 일반대학원 Yoon, Sang-Young 일반대학원 분자과학기술학과 2007. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000001879 octameric oligomer esterase metagenome Esterases have currently enormous attention because of their biotechnological potential in medicine, synthetic chemistry, and food processing. To investigate possibility of commercial usage, esterases with high thermostability and specific enantioselectivity was identified from a metagenome. We characterized a novel estease. The DNA sequence length of this new cloned esterase is 1170 bp, designated as EST-Y29, and it encoding a protein of 389 amino acids with 42.8 kDa. Amino acid sequence analysis of Est-Y29 showed only moderate identity (<35%) to known esterases/lipases in the databases. In addition, the conserved sequence motifs of esterases/lipases such as G-X-S-X-G or H-G-G-G was not found in Est-Y29. The apparent molecular weight of Est-Y29 was estimated to 42.7kDa by SDS-PAGE, but to 387 kDa through size-exclusion column. Therefore, we could presume the EstY-29 has oligomeric forms. EST-Y29 was functionally overexpressed in a soluble form in E. coli with maximum conversion yield of (S)-ketoprofen at 65°C. Taken together, a novel oligomeric esterase with thermostability and enantioselectivity was obtained from a metagenome.