신호준 최경진 2008-02 6064 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/5173 학위논문(석사)----아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2008. 2 파울러 자유아메바는 토양, 연못, 습지, 물 및 하수의 침전물 등에 존재하며, 사람이나 실험동물에서 원발성 아메바성 수막뇌염 (PAME: primary amoebic meningoencephalitis)을 일으키는 병독성 병원체이다. 신경소교세포는 중추신경계 (CNS: central nervous system)내의 중요한 염증세포이며, 뇌의 신경변성질환과 손상에 의해 활성화된다. 활성화된 신경소교세포 (microglia)는 염증 반응과 관련하여 사이토카인을 분비하는 것으로 알려져 있다. 원발성 아메바성 수막뇌염을 일으키는 파울러자유아메바 감염 뇌세포에서 사이토카인 발현양상은 충분히 밝혀져 있지 않으며, 또한 사이토카인 발현에 관계된 신호전달에 관한 연구는 미비하다. 본 연구에서는 신경소교세포에 파울러 자유아메바 세포전체추출액을 처리 한 후 사이토카인 분비 양상과 신호전달 체계를 관찰함으로써 면역반응 조절기전을 알아내고자 하였다. 사이토카인의 mRNA 발현양상을 RPA (RNase Protection Assay)방법으로 관찰하였는데, 세포 추출액을 처리한 후 IL-18과 IFN-γ의 두 가지 사이토카인들의 mRNA 발현이 증가되었고, IFN-γ의 발현 보다 IL-18의 발현이 더 증가하였다. 파울러자유아메바의 전체세포추출액에 의해서 MAPK (Mitogen activated protein kinase)활성을 증명하기 위해 Western blot 방법을 시행한 결과, 세 가지 MAPK 모두 활성을 나타냈다. 또 활성이 증가된 이들 MAPK 단백이 사이토카인의 mRNA발현에 관련되어 있는지 알아보기 위해, MAPK 특이 억제제(ERK inhibitor, U0126; p38 inhibitor, SB202190; JNK inhibitor)를 이용하여 실험하였다. 그 결과 세 가지 MAPK 억제제에 의해 IL-18과 IFN-γ의 발현이 감소하는 것을 나타냈다. 파울러자유아메바의 전체 세포추출액에 의한 사이토카인 전사인자 활성을 증명하기 위해 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 방법을 이용하여 전사활성인자인 AP-1과 NF-κB의 활성을 알아보았는데, 두 가지 전사인자 모두 활성을 보였다. JNK와 p38의 각각의 저해제를 처리한 후 AP-1과 NF-κB 전사인자의 활성이 억제되었다. JNK의 활성은 AP-1과 연관되어 있었고 p38은 NF-κB와 연관되어 있었다. 결과적으로 파울러자유아메바의 전체 세포추출액을 신경소교세포에 자극을 주었을 때, IL-18과 IFN-γ 유전자 발현이 증가되며 그 과정에 MAPK와 AP-1 그리고 NF-κB을 통해서 활성이 일어나는 것으로 관찰되었다. 파울러자유아메바의 전체세포추출액에 의해 마우스 신경소교세포에서 선택적인 사이토카인이 발현됨으로써 아마도 중추신경계 질환에서 면역세포를 유인하기 위하여 사이토카인을 발현하여 염증반응을 개시하는 역할을 할 것으로 생각된다. Ⅰ. 서론 (Introduction) = 1 A. 원발성 아메바성 수막뇌염(PAME :primaryamoebicmeningoencephalitis) = 1 B. 신경소교세포 (microglia)에 의한 사이토카인 발현 = 2 C. 사이토카인 발현에 연관되어 있는 세포신호전달 = 4 D. 연구목적 = 5 Ⅱ. 재료 및 방법 (Materials and Methods) = 7 A. 파울러자유아메바의 배양 및 전체 세포 추출액 제조 = 7 B. 신경소교세포 (BV2 cell line)배양 = 7 C. 사이토카인들의 mRNA 발현 확인 = 7 1. 전체 RNA 분리 = 7 2. RPA (RNase protection assay) 분석 = 8 D. MAPK (Mitogen activated protein kinase) 활성 측정 = 9 1. 전체 단백질 채취 = 9 2. Western blot 분석 = 10 E. 전사인자의 활성 측정 = 10 1. 핵 안의 단백질 추출 = 10 2. EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 분석 = 11 Ⅲ. 결과 (Results) = 12 A. 파울러자유아메바로 부터 전체세포추출액 제조 = 12 B. 파울러자유아메바 전체세포추출액에 의한 사이토카인의 mRNA 활성 = 13 C. 파울러자유아메바 전체세포추출액에 의한 신경소교세포의 MAPK 활성 = 13 D. 파울러자유아메바 전체세포추출액에 의한 사이토카인 발현과 MAPK의 연관성 = 16 E. 파울러자유아메바 전체세포추출액에 의한 전사인자의 활성 = 18 F. 파울러자유아메바 전체세포추출액에 의한 전사인자와 MAPK 활성과의 연관성 = 19 Ⅳ. 고찰 = 21 Ⅴ. 결론 = 28 참고문헌 = 29 ABSTRACT = 41 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 병원성 파울러자유아메바의 전체세포 추출액에 의한 신경소교세포주의 사이토카인 발현 양상 Choi, Kyung Jin Thesis 아주대학교 일반대학원 Choi, Kyung Jin 일반대학원 분자과학기술학과 2008. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000006064 파울러자유아메바 사이토카인 AP-1 MAPK microglia NF-κB Naegleria fowleri, a free living amoeba widespread in moist soil, water and sediment, exist as a virulent pathogen causing fetal primary amoebic meningoencephalitis (PAME) in experimental animals and in human. Microglial cells are the major inflammatory cells in the central nervous system (CNS) and become activated in response to brain injury following trauma and neurogenerative disease. Moreover, activated microglial cells are known to release pro-inflammatory cytokines. However, the response of microglial cells to N. fowleri infection was little known. In addition, cell signaling pathway about cytokine induction of microglial cells in N. fowleri infection are unknown. To understand the pathogenic mechanisms involved in the initiation of inflammatory response in the CNS following N. fowleri infection, cytokines production in mouse BV2 cell was analyzed. In addition, mRNA cytokine gene activation was examined by RNase protection assay (RPA) in BV2 cells. We demonstrated here that N. fowleri was potent selective inducer for IL-18 and IFN-γ in mouse microglial cells. IL-18 mRNA induction was higher than IFN-γ induction after N. fowleri lysate stimulation. In order to demonstrate MAPK (mitogen-activated protein kinase) activation by N. fowleri lysate stimulation, Western blot was carried out. On the results, all MAPK were activated. To examine whether MAPK is necessary for the activation of cytokine genes after N fowleri lysate treatment, cells pretreated for 1 h with specific inhibitors for ERK, p38, and JNK (U0126, SB2024190, and JNK inhibitor) were subsequently stimulated with N fowleri lysate. Interestingly, these treatments inhibited IL-18 and IFN-γ mRNA production in a dose-dependent manner. Otherwise, activation of MAPK with cytokines production, activation of a potential downstream transcription factor, NF-κB and AP-1 were assessed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). NF-κB and AP-1 transcription factor are activated after N fowleri lysate treatment. To examine whether activation of NF-κB and AP-1 was assessed following N fowelri lysate treatment in the presence of inhibitors for MAPK. NF-κB activation was dependent of p38 activation, and AP-1 activation was dependent of JNK activation. NF-κB and AP-1 activation was independent of ERK-1/2 activation. In this study, microglial cells treated with N. fowleri lysate induced IL-18 and IFN-γ expression. The MAPK is responsible for N. fowleri-induced IL-18 and IFN-γ expression in microglial cell treated with N. fowleri lysate. It may be suggested that cytokines activation are most likely to play a major role in the initiation of inflammatory responses to N. fowleri infection in the CNS.