최용준 강대욱 2023-02 32459 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/24313 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2023. 2 Gasdermin 계열 단백질은 세포막에 구멍을 만들어 파이롭토시스 (pyroptosis)를 일으키는 단백질로 최근에 밝혀졌다. 우리 연구실에서는 Gasdermin 계열 단백질들이 세포고사 엑소좀 (apoptotic exosome) 생합성에 관여하는 것을 규명하였다. Gasdermin 계열 단백질 중에서 세포고사 엑소좀 방출량이 가장 높은 Gasdermin E로 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 Gasdermin E가 엑소좀 생성량을 증가시키는 것을 보기 위해 Gasdermin E를 발현 시켜 생성된 엑소좀 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. Gasdermin E가 세포고사 엑소좀 생합성에 관여하는지 확인하기 위해 엑소좀 마커인 CD63을 과발현한 HeLa 세포를 공초점 현미경 (confocal microscope)으로 확인하였고, 세포질 내 칼슘 이온이 세포고사 엑소좀 생합성에 관여하는지 확인하기 위해 세포질 내 칼슘 이온을 efluor™ 514 칼슘 이온 센서 염료로 확인하였다. 그 결과 엑소좀 양을 엑소좀 마커 S1PR1, S1PR3, CD63으로 확인하여 Gasdermin E가 발현될 때 엑소좀 방출량이 증가하는 것을 확인하였다. HeLa 세포에서는 생합성에 중요한 multivesicular bodies (MVBs) 성숙 (maturation) 과정이 세포질 막 근처에서 발생하는 것을 확인하였는데, Gasdermin E-녹아웃 세포에서 MVBs 성숙 과정이 발생하지 않았고 세포 내 intraluminal vesicles (ILVs)를 포함한 MVBs 수가 감소하였음을 확인하였다. 세포질 내 칼슘 이온 농도에 따라 세포고사 엑소좀 방출량을 알아보았는데 칼슘 이온 농도 조절을 하기 위해 칼슘 이온 킬레이트제 (BAPTA-AM, 50 μM), 칼슘 이온 운반체 (A23187, 1 μg/ml) 를 HeLa 세포, Gasdermin E-과발현 시킨 HeLa 세포, Gasdermin E-녹아웃 HeLa 세포에 처리하여 엑소좀 양을 측정하였는데 세포질 내 칼슘 이온이 증가할 때 엑소좀 방출량이 증가하는 것을 확인하였고, 세포질 내 칼슘 이온이 감소할 때 엑소좀 방출량도 감소하는 것을 확인하였다. 칼슘 이온을 제거한 배지와 칼슘 이온이 존재하는 배지로 세포질 내 칼슘 이온을 측정하였는데 세포 밖 칼슘 이온 여부와 상관없이 세포질 내 칼슘 이온 농도가 증가한 것을 확인하였다. 즉 칼슘 이온은 Gasdermin E로 인해 만들어진 엔도솜 막 구멍을 통해 엔도솜 내강에서 세포질로 유입 되고 세포질 내 칼슘 이온 농도가 증가함에 따라 세포고사 엑소좀 생성량이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 Gasdermin E는 엑소좀 생합성에서 중요한 과정인 MVBs 성숙에 관여하고 Gasdermin E로 인해 생성된 엔도솜 막을 통해 세포질 내로 칼슘 이온이 유입 되어, 칼슘 이온이 세포고사 엑소좀 생합성에 관여하는 것을 밝혔다. Ⅰ. 서론 1 <br>Ⅱ. 재료 및 방법 9 <br> A. 세포, 항체 9 <br> B. PCR and In-fusion 클로닝 9 <br> C. Lentiviral vector 형질주입 10 <br> D. CRISPR / Cas9 녹아웃 10 <br> E. PiggyBac transposon system 11 <br> F. 웨스턴 블롯 12 <br> G. Calcium fluorescence luminometer 13 <br> H. 공초점 현미경을 통한 분석 (Confocal microscopy) 14 <br> I. 분별 원심분리 (Differential centrifugation) 15 <br> J. 나노 입자 추적 분석 (Nanoparticle tracking analysis) 15 <br>Ⅲ. 결과 17 <br> A. Gasdermin E 전장 발현이 세포고사 엑소좀 생합성에 관여한다. 17 <br> B. 세포자멸사 과정에서 Gasdermin E는 MVBs 형성에 관여한다 (1). 19 <br> C. 세포자멸사 과정에서 Gasdermin E는 MVBs 형성에 관여한다 (2). 21 <br> D. 세포질 내 칼슘 이온은 세포고사 엑소좀 생합성에 관여한다. 23 <br> E. 세포자멸사 과정에서 Gasdermin E에 의해 형성된 엔도솜 막을 통해 칼슘 이온이 세포질로 유입된다. 25 <br>Ⅳ. 고찰 27 <br>Ⅴ. 결론 29 <br>참고문헌 30 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Gasdermin E 매개 칼슘 이온이 세포고사 엑소좀 생합성에 미치는 영향 Effect of increased cytosolic calcium ion provoked by Gasdermin E in the biogenesis of Apoptotic exosomes Thesis 아주대학교 대학원 KANG DAE WOOK 일반대학원 의생명과학과 2023-02 Master https://dcoll.ajou.ac.kr/dcollection/common/orgView/000000032459 엑소좀 The Gasdermin family has recently been identified as a protein that causes pyroptosis by making pores in the cell membrane. In our lab, we investigated the involvement of the Gasdermin family in the biogenesis of apoptotic exosomes. In the Gasdermin family, the study was conducted with Gasdermin E, which releases the highest number of apoptotic exosomes. For this study, in order to confirm that Gasdermin E increases the number of exosomes produced, the amount of exosome expressing Gasdermin E was confirmed by means of western blot. To determine whether Gasdermin E is involved in the biogenesis of apoptotic exosomes, HeLa cells overexpressing the exosome marker CD63 were confirmed with a confocal microscope. We also wanted to ascertain that in the, cytoplasm calcium ions were involved in the biogenesis of apoptotic exosomes for this purpose, calcium ions in the cytoplasm were identified with the eFluor™ 514 calcium ion sensor dye. To analyze the results, the number of exosomes was confirmed with exosome markers S1PR1, S1PR3, and CD63, and it was found that the quantity of exosomes released increased in Gasdermin Eexpressed cells. In HeLa cells, it was confirmed that the maturation process of multivesicular bodies (MVBs), which is important for the biogenesis of exosomes, occurred near the cytoplasmic membrane, and that the number of included MVBs decreased. The amount of apoptotic exosomes released was investigated based on the concentration of calcium ions in the cytoplasm. To regulate the concentration of calcium ions, HeLa cells, Gasdermin E <br>overexpression HeLa cells, and Gasdermin E knockout HeLa cells were treated with a calcium ion chelator (BAPTA-AM, 50 μM), and a calcium ionophore (A23187, 1 μg/ml). Upon analyzing the results. it was confirmed that the number of exosomes released increased when the calcium ions in the cytoplasm increased, In order to determine whether, the quantity of exosomes released when the calcium ions in the cytoplasm decreased. A medium without calcium ions and a medium with calcium ions was used, and it was found that the concentration of calcium ions in the cytoplasm increased regardless of whether there were extracellular calcium ions or not. That is, it was confirmed that the calcium ions flowed into the cytoplasm from the lumen of the endosome through the endosomal membrane pores made by Gasdermin E, and the <br>concentration of calcium ions in the cytoplasm increased the number of apoptotic exosomes released. Therefore, it can be concluded that Gasdermin E is involved in the maturation of MVBs, an important process in exosome biogenesis, and calcium ions are involved in the biogenesis of apoptotic exosomes and flow into the cytoplasm through the endosomal membrane pores created by Gasdermin E.