윤현진 김예은 2022-02 31439 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/21022 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :분자과학기술학과,2022. 2 산성 조건에서 병원성 대장균이 생존하면 특히 김치와 같은 산성 식품에서 식품 안전에 심각한 위험을 초래합니다. 내산성에 필요한 세균 인자를 확인하기 위해 내산성 장독소성 대장균 (enterotoxigenic Escherichia coli) 균주에 대한 전사체 분석을 수행하였고, 산성 pH에서 발현이 유의하게 변화하는 유전자를 산성 스트레스에 대한 추정적 내성 인자로 선택하였습니다. 글루타메이트 의존성 산 저항성(GDAR) 시스템 및 구리 저항성과 관련된 유전자가 여기에 포함되었습니다. GDAR 시스템의 구성 요소인 GadA, GadB 또는 YbaST가 없는 E. coli 균주는 산성 스트레스 조건에서 성장 및 생존이 유의하게 약화하였습니다. 따라서, 3-메르캅토프로피온산 (3-mercaptopropionic acid)과 아미노옥시아세트산 (aminooxyacetic acid)에 의한 GDAR 시스템의 억제는 산성 조건에서 세균의 적응력과 생존력을 제거하였고, 이것은 GDAR 시스템이 내산성에 필수적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 흥미롭게도, 구리 저항성 유전자에 대한 전사 조절자를 인코딩하는 cueR의 결여는 구리뿐만 아니라 산 스트레스에 대한 박테리아 저항성을 현저하게 손상했습니다. 반대로 YbaST가 없으면 구리에 대한 박테리아 내성이 심각하게 손상되어 산과 구리 내성 사이의 상호 작용을 암시합니다. 이러한 결과는 산 및 구리 처리에 대한 E. coli 내성을 방지하기 위한 제어 수단을 개발하는 데에 GDAR 시스템이 유망한 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 1. Introduction 1 2. Materials and Methods 4 2.1. Bacterial strains and plasmids construction 4 2.2. Bacterial growth conditions and acid treatments 8 2.3. RNA extraction and RNA-Sequencing (RNA-Seq) 8 2.4. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis 11 2.5. Viability assay 15 2.6. Statistical analysis 15 3. Results 16 3.1. Extreme acid stress induced the expression of AR2 system-associated genes 16 3.2. GDAR system and Cue system are resistance factors against extreme acid stress 27 3.3. 3-Mercaptopropionic acid and aminooxyacetic acid block acid resistance in E. coli 33 3.4. GDAR system and copper resistance genes as resistance factors against copper stress 39 4. Discussion 42 5. Reference 46 6. Abstract in Korean 52 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Identification of Resistance Factors Required for Escherichia coli Survival against Acid and Copper Stresses Thesis 아주대학교 일반대학원 Yeeun Kim 일반대학원 분자과학기술학과 2022. 2 Master I804:41038-000000031439 https://dcoll.ajou.ac.kr/dcollection/common/orgView/000000031439 Escherichia coli copper resistance glutamate-dependent acid resistance system Persistence of pathogenic Escherichia coli under acidic conditions poses a serious risk to food safety, especially in acidic foods such as Kimchi. In order to identify the bacterial factors required for acid resistance, transcriptomic analysis was conducted on acid-resistant enterotoxigenic Escherichia coli strains and the genes with significant changes in their expression under acidic pH were selected as putative resistance factors against acid stress. These genes included genes associated with the glutamate-dependent acid resistance (GDAR) system and copper resistance. E. coli strains lacking GadA, GadB, or YbaST, the components of GDAR system, were significantly attenuated in their growth and survival under acidic stress conditions. Accordantly, the inhibition of GDAR system by 3-mercaptopropionic acid and aminooxyacetic acid abolished bacterial adaptation and survival under acidic conditions, indicating an indispensable role of GDAR system for acid resistance. Intriguingly, the lack of cueR encoding a transcriptional regulator for copper resistance genes markedly impaired bacterial resistance to acid stress as well as copper. Conversely, the absence of YbaST severely compromised bacterial resistance against copper, suggesting an interplay between acid and copper resistance. These results suggest that GDAR system can be a promising target for developing control measures to prevent E. coli resistance to acid and copper treatments.