백승훈 김민영 2022-02 31695 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/20601 학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :약학과,2022. 2 전 세계를 강타한 팬데믹 (Pandemic) 상황은 바이러스성 질병의 위험성을 고취시키며 안전하고 효과적인 치료제의 개발을 촉구한다. 치료적 대안으로써 천연 다당류는 항바이러스, 항암 및 항염 효과를 비롯한 다양한 생리활성 효과를 가지는 생체 고분자이다. 본 연구에서는 전통적으로 감염성 질병의 치료를 위해 사용된 지유 (Sanguisorba officinalis, SO)의 뿌리에서 천연 다당류를 분리하고, 분리된 다당류의 구조와 항엔테로바이러스 71 (Enterovirus 71, EV71) 효과를 밝히는 것을 목표로 하였다. 세 가지 주요 다당류 (S-a3, S-c2 및 S-d3)가 지유로부터 크로마토그래프법을 통해 분리, 정제되었으며 각각은 260.4, 93.2 및 95.9 kDa의 분자량 분포를 가지는 균질한 고분자였다. 정제된 다당류의 표면 형태는 주사전자현미경 (scanning electron microscope)을 통해 관찰되었고, 다공성과 표면의 거친 정도에서 다소 차이를 보였다. 글리코시드 결합 분석 (glycosidic linkage analysis)과 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance) 분석을 통해 세 가지 다당류의 주요 골격이 확인되었고, S-a3는 호모갈락투로난 (homogalacturonan), 람노갈락투로난-I (rhamnogalacturonan-Ⅰ), 1,4-α-글루칸 (1,4-α-glucan) 및 아라비노갈락탄 (arabinogalactan)이 서로 결합된 형태로 보여졌다. S-c2는 호모갈락투로난 만으로 구성되어 있었고 S-d3는 아라비난 (arabinan)과 람노갈락투로난-I으로 구성되어 S-a3보다 비교적 단순한 구조의 다당류로 확인되었다. 정제된 다당류의 항바이러스 활성은 EV71에 감염된 Vero 세포와 hSCARB2 형질전환 마우스 모델을 이용하여 in vitro와 in vivo 환경에서 평가되었고, 활성은 S-a3에서만 발견되었다. S-a3는 EV71에 감염된 Vero 세포의 세포 사멸과 세포내 바이러스 유전자 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 또한 EV71에 의해 유발된 hSCARB2 형질전환 마우스 모델의 사지 마비, 체중 감소 및 사망을 유의미하게 지연시켰다. 한편, S-a3는 세포와 마우스에 무독성이었다. S-a3의 항바이러스 기전은 감염의 초기 단계에서 일어나는 EV71의 부착과 깊은 관련이 있었다. 우리의 연구 결과는 지유에서 분리된 주요 다당류의 구조적 차이를 밝히고 지유의 특정 다당류가 EV71 감염에 대한 안전하고 효과적인 치료법이 될 수 있음을 시사한다. 1. Introduction 1 1.1. Natural polysaccharides 1 1.2. Enterovirus 71: Causative virus in hand, foot, and mouth disease 7 1.3. The roots of Sanguisorba officinalis (SO; Rosaceae) 10 1.4. Specific aims 12 2. Materials and methods 13 2.1. Plant materials and reagent 13 2.2. DNA barcoding analysis for molecular authentication of SO 13 2.3. Extraction, isolation, and purification of polysaccharides 16 2.4. Analysis of chemical components 17 2.5. Homogeneity and molecular weight 17 2.6. Scanning electron microscope (SEM) analysis 18 2.7. Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) 18 2.8. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) 18 2.9. Carboxyl reduction 19 2.10. Monosaccharide composition analysis 20 2.11. Methylation and linkage analysis 20 2.12. GC-MS condition 21 2.13. Viruses and cell lines 22 2.14. Virus infection 22 2.15. Cell viability assay 23 2.16. Quantitative real-time PCR 23 2.17. Time-of-addition and time-course assay 24 2.18. Western blot 25 2.19. Immunofluorescence 25 2.20. Animal experiment 26 2.21. Statistical analysis 26 3. Results and Discussion 27 3.1. Molecular authentication of SO 27 3.2. Isolation and molecular weight of S-a3 30 3.3. Chemical components and monosaccharide composition of the purified polysaccharides 34 3.4. SEM and FT-IR analysis of the purified polysaccharides 41 3.5. Linkage analysis of the purified polysaccharides 45 3.6. NMR analysis of the purified polysaccharides 73 3.6.1. Characterization of S-a3 77 3.6.2. Characterization of S-c2 84 3.6.3. Characterization of S-d3 88 3.7. Potential antiviral activity of the purified polysaccharides 92 3.8. Inhibitory activity of S-a3 against EV71 infection in vitro 96 3.9. Direct binding of S-a3 with EV71 for inhibition of EV71 100 3.10. Time-of-addition and time-course assay of S-a3 in EV71-infected cells 102 3.11. Mitigation of EV71 infectivity by co-injection of EV71 and S-a3 in mice 104 3.12. Structure-activity relationship of the purified polysaccharides 107 4. Conclusion 108 Acknowledgements 110 Reference 110 국문 초록 124 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Structure analysis and antiviral activity of pectic polysaccharides from the roots of Sanguisorba officinalis against enterovirus 71 in vitro and in vivo Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 약학과 2022. 2 Doctoral I804:41038-000000031695 https://dcoll.ajou.ac.kr/dcollection/common/orgView/000000031695 Antiviral activity Arabinogalactan Enterovirus 71 Glucan Pectin Sanguisorba officinalis The increasing prevalence of viral diseases and the pandemic risk urge the development of safe and effective treatments. As a therapeutic candidate, natural polysaccharides are biopolymers having various biological effects, including antiviral, anticancer, and anti-inflammatory effects. In this study, we aimed to isolate natural polysaccharides from the roots of Sanguisorba officinalis (SO), traditionally used for the treatment of infectious diseases, and to elucidate the structure and anti-enterovirus 71 (EV71) effects of the isolated polysaccharides. Three major polysaccharides (S-a3, S-c2, and S-d3) were isolated from SO, and each was homogenous macromolecules (260.4 kDa, 93.2 kDa, and 95.9 kDa, respectively). The purified polysaccharides showed surface morphological differences in porosity and smoothness. Linkage and NMR analysis confirmed that S-a3 is a polysaccharide interlinked together with homogalacturonan, rhamnogalacturonan-I, 1,4-α-glucan, and arabinogalactan, and S-c2 and S-d3 were polysaccharides with relatively simple structures composed of homogalacturonan, arabinan, and rhamnogalacturonan-I. Antiviral activity was found only in S-a3. S-a3 significantly inhibited cell death and viral gene expression in the EV71-infected Vero cell and alleviated EV71-induced body weight loss, death, and paralysis in the hSCARB2 transgenic mice model. The effective dose of S-a3 was non-toxic to cells and mice. The antiviral mechanism of S-a3 was associated with disruption of EV71 attachment to host cells. Our findings reveal structural differences in the major polysaccharides purified from SO, demonstrating that a polysaccharide of SO can be a safe and effective treatment for EV71 infection.