박영준 장진동 2021-02 30633 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/20312 학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :응용생명공학과,2021. 2 주름은 얼굴에 존재하는 근육의 분포와 근육의 움직임에 따라 발생하게 되는데, 젊었을 때는 피부의 탄력과 세포의 왕성한 재생능력으로 인해 주름이 생기지 않지만 나이가 들어감에 따라 피부의 탄력성이 낮아지고 세포재생 능력이 감소함에 따라 주름이 발생하게 된다. 주름을 발생시키는 피부 노화는 내인성과 외인성에 모두 기인하는 복합적인 생물학적 과정이다[1]. 내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 발생하는데 유전적 요인과 호르몬의 영향 등 다양한 원인이 있고, 외인성 노화는 주로 햇빛의 자외선에 의해 영향을 받는다. 주름의 원인이 되는 피부노화는 내인성과 외인성의 복합적인 작용으로 발생한다[2-3]. 주름 발생의 원인인 피부노화를 방지하고 개선하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. 대표적인 피부노화 연구로는 항당화, 활성산소에 피부 조직의 손상 방지 및 회복, 텔로미어와 관련한 Cell Cycle의 개선 등이 있다. 당노화는 과다한 당이 Collagen 등의 Proteins과 결합하여 최종당화산물(AGEs)를 생성하여 구조를 변형시켜 피부 톤이 어두워지고 탄력이 떨어져 피부노화를 야기시키는 것이다[50-51]. 텔로미어(Telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 Hexamer 형태의 염기서열로 세포가 한 번 재생될 때마다 하나씩 떨어져 나가 모두 사용되면 더 이상 세포는 재생되지 않는다. 텔로미어는 젊었을 때는 Telomerase가 분비되어 정상적으로 재생되지만 DNA의 손상이나 Telomerase의 변이 등에 의해 Telomere가 짧아지게 되면, Cell Cycle이 정지되어 노화를 일으킨다[56-57]. 활성산소는 MMPs의 발현을 증가시켜 Collagen, Elastin 등의 피부조직을 구성하는 Proteins을 분해시켜 피부를 노화시킨다[58-60]. 모발은 Anagen, Catagen, Telogen의 3가지 단계를 순환하면서 성장과 탈락을 반복한다[84-85]. Anagen Phase의 모발을 Catagen이나 Telogen으로 전환시키면 탈모가 발생하고, Telogen 상태의 모발을 Anagen 상태로 전환시키면 Hair-Growth 발생하게 된다. 탈모를 유발하는 가장 큰 원인 중 하나는 Testosterone이 5α-Reductase에 의해 DHT로 전환이 되며, DHT가 TNF-β, DKK1, BMP 등의 발현을 증가시켜 모낭에서 세포의 사멸을 유도하여 탈모를 유발하는 것이다[88-89]. 노화에 따라 발생하는 주름과 탈모를 예방 또는 개선하기 위해 천연 수생식물인 마름(Trapa japonica)을 선정하였다. 마름 열매의 항염 효능에 대해서는 어느 정도 알려져 있었지만[103], 구체적인 효능과 성분에 대한 연구는 많지 않았다. 마름을 열수 추출하여 2가지의 복합 균주를 사용하여 발효하였다. 얻어진 발효 여과물을 Solvent를 이용하여 분획한 후 효능을 평가하였다. 효능이 가장 우수한 Fraction에 대해 Sephadex-LH20, RP-Column, HPLC-prep의 단계로 분리 및 정제하여 6개의 Peptides fraction을 얻었다. 6개의 Peptide의 Anti-Ageing과 Anti-Hair Loss 효능을 비교하여 그 중 가장 우수한 AC2- Peptide를 선정하여 NMR 분석을 통해 구조를 확인하였고, 최종적으로 PEP (Tripeptide-72)를 생합성을 통해 얻었다. 마름 발효물을 분리·정제하는 과정에서 얻어진 소재들과 천연에서 분리한 Peptide, 합성 Pedptide에 대해 Anti-Aging 및 Hair Growth 효능 시험을 진행하였다. Anti-Aging 확인 시험으로 진행한 Cell Viability (Wst-1) Assay, Collagen Synthesis Assay, RT-PCR (MMP-1, MMP-9), Wound Healing Assay, Clinical Trial에서 모두 우수한 효능을 확인하였으며, Hair Follicle Dermal Papilla Cell에서의 Cell Viability Assay, Cell Migration Assay, Immunofluorescence (IF) Staining, Organotypic 3D Cell Culture, Flow Cytometry 시험을 통해 5α-Reductase 발현 감소 및 DHT로부터 모유두 세포가 받는 Damage 감소를 통해 Anti-Hair Loss, Hair-Growth 효능이 있음을 확인하였다. 위 실험들을 통해 마름열매추출물, 마름열매발효물, 마름발효물로부터 얻은 Peptide, 합성 Peptide 모두 피부와 모발에 효능이 우수하여 화장품의 기능성 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었다. Ⅰ. 서 론 1 1. 주름(Wrinkle) 4 2. 피부 노화의 원인 및 현상 8 2.1. 노화 피부의 이상현상 12 2.2. 피부 항노화 연구 12 2.2.1. 당노화(AGEs, Advanced Glycation End Products) 12 2.2.2. 텔로미어에 기인한 노화(Ageing-Telomere) 15 2.2.3. 활성산소에 기인한 노화(ROS, Reactive Oxygen Species) 16 3. 탈모의 원인 및 소재개발 현황 16 3.1. 탈모의 원인 19 3.2. 탈모관련 소재 현황 21 3.3 탈모관련 소재개발 방향 23 3.3.1. 모모세포(Keratinocyte Cell) 활성 촉진 23 3.3.2. 피지분비의 억제 23 3.3.3. 남성호르몬(Androgen)의 DHT로의 전환억제 24 3.3.4. TGF-β1 활성 억제 25 3.3.5. JAK-STAT 억제 26 3.3.6. 천연물 연구 28 4. 발효 30 5. 펩타이드(Peptide) 32 6. 마름(Trapa japonica fruit) 37 Ⅱ. 재료 및 방법 39 1. 재료 및 기기 39 1.1. Reagent 39 2. 시험재료 준비 40 2.1. Trpa japonica fruit extract (TJEs) 준비 40 2.2. TJEs의 Solvent Fraction 준비 41 2.3. TLC를 이용한 분리 정제 41 2.4. Bacillus/Trapa japonica fruit extract Ferment (TJFs) 준비 42 2.5. Bacillus/Trapa japonica fruit extract Ferment (TJFs) 분획물 준비 42 2.6. 펩타이드 분리 정제(Fraction and Isolation) 44 2.7. 펩타이드 합성(Peptide Synthesis) 44 3. 단백질 농도 분석(Lowry Assay) 45 3.1. 천연물 및 발효물에서의 단백질 정량 45 3.2. 발효물 및 발효분획물에 대한 펩타이드 정량분석 46 4. 마름발효물(TJFs)에 대한 항산화(DPPH) 효능평가 47 5. 피부에 대한 효능 평가 48 5.1. HDF Cell 증식능(Wst-1 Assay) 48 5.2. 콜라겐합성(Measurement of Collagen Synthesis) 48 5.3. MMP-1, MMP-9 합성 저해능 평가(RT-PCR) 48 5.4. Wound Healing Assay 49 5.5. 항노화 효과에 대한 임상시험(Clinical Trial) 49 6. 모발에 대한 효능평가 50 6.1. HDP Cell Culture 50 6.2. HDP Cell Wst-1 Assay 50 6.2.1. TJFs에 대한 Assay 50 6.2.2. AC2-Peptide에 대한 Assay 51 6.3. ELISA Assay 51 6.4. Western Blotting 52 6.4.1. TJFs에 대한 Assay 52 6.4.2. AC2-Peptide에 대한 Assay 52 6.5. Cell Migration Assay 53 6.6. 면역형광검사(Immunofluorescence (IF) Staining) 53 6.7. Determination of Cell Cycle 54 6.7.1. TJFs에 대한 Test 54 6.7.2. AC2-Peptide에 대한 Test 54 6.8. Organotypic 3D Cell Culture Model 54 6.8.1. TJFs에 대한 Test 54 6.8.2. AC2-Peptide에 대한 Test 55 6.9. Immunohistochemistry (IHC) 55 6.9.1. TJFs에 대한 Test 55 6.9.2. AC2-Peptide에 대한 Test 55 6.10. Immunoprecipitation 56 7. 통계분석(Statistical Analysis) 56 Ⅲ. 시험 결과 57 Part A. TJEs, TJFs의 분리·정제 및 각 Fractions의 효능평가 57 1. TJEs 추출 용매별 효능평가 57 1.1. TJEs 추출 용매별 세포 생존율 57 1.2. TJEs Solvent Fraction에 따른 Collagen Synthesis Assay(ELISA) 58 1.3. TJEs Solvent Fraction에 따른 Wound Healing Assay 60 1.4. TJEs Solvent Fraction에 따른 5α-Reductase Type1 억제효능 평가 61 1.5. RT-PCR을 이용한 마름추출물 Water fraction의 주름개선 효과 검증 62 1.6. Immunohistochemistry를 이용한 TJEs Water fraction의 탈모방지 및 육모에 대한 효능검증 63 2. TJFs의 효능평가 64 2.1. 발효 전후의 펩타이드 양 변화 64 2.2. DPPH Assay를 이용한 항산화 효능평가 66 3. 마름 발효물 분리정제 68 3.1. Sephadex-LH20 Column을 통한 마름발효물 분리정제 69 3.2. RP-Silica Column을 이용한 분리 정제 70 3.3. HPLC-prep을 통한 추가 분리정제 74 4. 발효물 내 펩타이드 라이브러리 구축 78 4.1. LC-MS/MS, LC-MS IT TOF를 통한 물질확인 실험 78 4.2. 천연물, 발효물 내 유효 펩타이드 서열분석 83 4.2.1. Tripeptide-G1 84 4.2.2. Tripeptide-G2 89 4.2.3. Tripeptide-G3 94 4.2.4. Tripeptide-G4 99 4.2.5. Hexapeptide-01 104 4.3. 유효 펩타이드 분리/정제 공정 구축 109 5. Tripeptide-G1 (PEP, Tripeptide-72) 제조공정 110 6. 마름발효물(TJFs)에서 분리·정제한 펩타이드의 효능평가 113 6.1. TJFs 유래 펩타이드의 세포 생존율 시험(Wst-1) 113 6.2. TJFs 유래 펩타이드의 콜라겐 합성능 시험(ELISA) 114 6.3. TJFs 유래 펩타이드의 Wound Healing Assay 115 6.4. TJFs 유래 펩타이드의 Type1 5α-Reductase 억제효능 116 Part B. Synthetic Peptide의 Anti-Aging 효능평가 117 7. PEP (Tripeptide-72)의 피부에서의 효능평가 117 7.1. TJFs 유래의 신규 Peptide (PEP) 합성 117 7.2. TJEs, TJFs, PEP의 세포증식 및 콜라겐 합성 효과 118 7.3. TNF-α에 기인한 MMP-1, MMP-9 발현 억제능 121 7.4. TJEs, TJFs, PEP의 Wound Healing Assay 122 7.5. 임상시험(Clinical Trial, Anti-Wrinkle) 123 Part C. TJFs & AC2-Peptide의 Hair-Growth 효능평가 125 8. TJFs의 탈모방지 및 육모관련 효능평가 125 8.1. TJFs의 HDP Cell에서의 Proliferation과 Migration 효과 125 8.2. TJFs가 Type1 5α-Reductase에 미치는 영향 128 9. AC2-Peptide의 탈모방지 및 육모관련 효능평가 130 9.1. Cytotoxic Activity와 Cell Cycle Arrest의 측정 130 9.2. AC2-Peptide의 mTOR-Raptor와의 상호작용 및 Autophagy와 Apoptosis 저해 효과 133 9.3. Flow Cytometry를 이용한 Apoptosis와 Autophagy 활성측정 136 9.4. ex-vivo 모델 증식에서 AC2-Peptide의 역할 137 9.5. PEP 합성 메카니즘과 HDP Cell에서의 효능평가 138 Ⅳ. 고 찰 139 Ⅴ. 결 론 143 참고 문헌 145 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 마름추출 발효물에서 분리한 펩타이드의 육모 및 항노화 연구 Thesis 아주대학교 일반대학원 Jang Jin Dong 일반대학원 응용생명공학과 2021. 2 Doctoral I804:41038-000000030633 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000030633 마름 발효 육모 펩타이드 항노화 Wrinkles are caused by the distribution of muscles in the face and the movement of muscles. When young, wrinkles do not form due to the elasticity of the skin and the ability of the cell to regenerate, but as the skin ages, wrinkles occur as the elasticity of the skin decreases and cell regeneration decreases. Wrinkle-producing skin aging is a complex biological process that results from both intrinsic and extrinsic[1]. Intrinsic aging occurs with age, with a variety of causes, including genetic factors and hormonal effects, and extrinsic aging is mainly affected by ultraviolet rays of sunlight. Skin aging, which causes wrinkles, is caused by a combination of intrinsic and extrinsic effects[2-3]. Many studies have been conducted to prevent and improve aging of the skin, which is the cause of wrinkles. Representive skin aging studies include anti-glycation, preventing and recovering skin tissues from ROS, and improving cell cycles related to telomeres. In glycation-induced Aging, excess sugar combine with Proteins such as Collagen to produce Advanced Glycation End products (AGEs), and AGEs darken the skin tone and reduce elasticity, finally causing skin aging[50-51]. A Telomere is a region of repetitive nucleotide sequences (Hexamer) at each end of a chromosome. Every time a cell is regenerated, the Hexamer is spended. If Hexamer is not exist, the cell will no longer regenerate. When young, telomerase is secreted and reproduced normally, but when telomere is shortened due to damage to DNA or mutations in Telomerase, the cell cycle stops and causes aging[56-57]. ROS increases the expression of MMPs degrade Proteins which make up skin tissues such as Collagen and Elastin, and it's induce skin aging[58-60]. Our hair cycles through three stages : Anagen, Catagen, Telogen repeating growth and fall out[84-85]. Conversion of hair from Anagen Phase to Catagen or Telogen causes hair loss, and converting hair from Telogen to Anagen state causes hair growth. One of the biggest causes of hair loss is that testosterone is converted to DHT by 5α-Reductase and DHT increase the expression of TNF-β, DKK1, BMP etc., leading to the death of cells in the hair follicle[88-89]. We selected Water Chestnut (Trapa japonica), a natural aquatic plant, to prevent or improve wrinkles and hair-loss caused by aging. Although some of the anti-inflammatory effects of T. japonica fruits were known, there were insufficient studies of specific effects and ingredients. T. japonica was extracted with heat water and fermented using two species of microbial. The efficacy evaluation was carried out after the obtained fermented extract was separated by Solvents. The six Peptide fractions were obtained by separating and refining from the most effective fraction into the stages of Shadex-LH20, RP-Silica Column, HPLC-prep. By comparing the anti-aging and anti-hair loss effects of six peptide, the best AC2-Peptide was selected and the structure was identified through NMR analysis, and then finally obtained PEP (Tripeptide-72) through Biosynthesis of amino acids. Anti-Aging and Hair Growth efficacy tests were conducted on materials obtained during the separation and purification process of fermented T. japonica extract (TJFs), Peptide (AC2-Peptide) separated from TJFs, and synthetic Pedptide (PEP). Cell Viability (Wst-1) Assay, Collagen Synthesis Assay, RT-PCR(MMP-1, MMP-9), Wound Healing Assay, Clinical Trial conducted with anti-aging verification tests were found to have excellent efficacy. Cell Viability Assay, Cell Migration Assay, Immunofluorescence (IF) Staining, Organotypic 3D Cell Culture, Flow Cytometry tests at the Hair Follicle Dermal Papilla Cell (HDPs) confirmed the anti-Hair-loss, Hair growth effectiveness by reducing the expression of 5α-Reductase and reducing the damage received from DHT at dermal papilla cell. Through the above experiments, T. japonica fruit extract (TJEs), Fermented T. japonica fruit extract (TJFs), Peptide obtained from TJFs (AC2-Peptide), Synthetic Peptide (PEP) were all effective in skin and hair, we could see th potential as a functional material of Cosmetic Science.