최권영 윤혜정 2021-02 30635 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/20241 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :환경공학과,2021. 2 본 연구는, 고분자에 대한 수요가 전 세계적으로 계속해서 증가하고 있고 지속 가능한 고분자 생산 공정 필요성 또한 커지는 추세에 따라 산업 바이오 공정을 이용하여 폴리아마이드 생성에 필요한 장쇄 지방족 알코올(fatty alcohol)을 장쇄 지방산(fatty acid)으로부터 전환하는 것이 주 목적이다. Fatty alcohol을 생성하기 위해서 Mycobacterium abscessus 로부터 유래한 carboxylic acid reductase(이하 ‘CAR’)를 expression 하였다. Mycobacterium abscessus로부터 유래한 카복시산 환원 효소(CAR) 효소는 long-chain fatty acid(LCFA)에 높은 기질 특이성이 있는 것으로 보고되었고 이전의 실험을 통해 확인되었다. [1-3] 또한, CAR 효소는 α, ω-dicarboxylic acid을 기질로 하여 장쇄 지방족 알코올을 얻을 수 있다. 하지만, 이 때 히드록시 장쇄 지방산(ω-hydroxy fatty acid)과 같이 부산물로서 존재하는 물질 때문에 장쇄 지방족 알코올로의 전환율이 떨어진다는 것을 GC-FID 분석을 통해 밝혔다. 그리하여 이러한 반응을 보낼 시 부산물과 지방족 알코올의 비율과 부산물인 히드록시 장쇄 지방산을 CAR 효소의 기질로 사용할 시 그 최대 전환 율 값을 분석하였다. 이 실험 결과로써 C12 히드록시 장쇄 지방산(12-hydroxydodecanoic acid)로부터 C12 장쇄 지방족 알코올로의 높은 생산량(76%)을 확인했고, 추가로 다른 히드록시 장쇄의 지방산의 기질 특이성의 확인과 그로부터 생산량을 분석하였다. 구체적으로 C10 히드록시 장쇄 지방산(10-hydroxydecanoic acid)과 C16 히드록시 장쇄 지방산(16-hydroxyhexadecanoic acid)으로부터 장쇄 지방족 알코올로의 전환 율을 분석하여 long-chain hydroxyl fatty acid 기질에 대한 특이성에 대해 밝혔다. 특히 12-hydroxydodecanoic acid 기질의 경우 docking simulation 결과를 통해 HO- 잔기와 hydrogen bonding/ charge-charge interaction으로 CAR 효소 활성이 증대되었다는 사실을 밝혔다. 이후 선별된 key residue를 조작한 효소의 mutant의 제조 및 활성 평가가 진행중이다. 이외에 세포 농도에 따른 히드록시 장쇄 지방산 기질로부터 장쇄 지방족 알코올로의 전환 율 또한 평가하였다. 제 1장. 서론 １ 제 1절 산업 바이오 공정 １ 제 2절 Carboxylic acid reductase ２ 제 3절 대장균 세포 내 반응 메커니즘 ４ 제 2장. 실험재료 및 방법 ６ 제 1절. Carboxylic acid reductase의 발현을 위한 Strain 개발 ６ 제 2절. 세포 배양 ８ 제 3절. 전 세포 반응(Whole cell reaction) ９ 제 4절. GC-FID 분석 １０ 제 3장. 실험결과 １１ 제 1절. Dodecanedioic acid의 농도 변화 및 최대 전환 량 １１ 제 2절. 12-hydroxydodecanoic acid 및 10-hydroxydecanoic acid, 16-hydroxyhexacanoic acid의 기질 농도 변화량 및 최대 전환 량 １３ 제 3절. OD600 값 차이에 따른 12-Hydroxydodecanoic acid의 전환 량 비교 １６ 제 4장. 결론 １９ 참고문헌 ２３ Abstract ２５ kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 카르복실산 환원 효소(CAR) 발현 재조합 대장균을 이용한 장쇄 지방산으로부터 지방 알코올의 생물 전환 연구 Biotransformation of long-chain fatty acids into long-chain alcohol using carboxylic acid reductase (CAR) expressing Escherichia coli. Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 환경공학과 2021. 2 Master I804:41038-000000030635 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000030635 Carboxylic acid reductase (CAR) Hydroxyl fatty acid Long-chain fatty acid This study aims to convert long-chain fatty alcohols (fatty alcohols) that require production from long-chain fatty acids (fatty acids) as the demand for production continues to increase worldwide and bio-industrial processes are also growing with sustainable production. Is the main purpose. It expresses a carboxylic acid reductase (hereinafter'CAR') derived from Mycobacterium abscessus to produce fatty alcohol. The carboxylic acid reductase (CAR) enzyme derived from Mycobacterium abscessus was confirmed through previous experiments where high substrate specificity was reported for long-chain fatty acids (LCFA). [1-3] In addition, CAR enzymes can obtain long-chain fatty alcohols using α,ω-dicarboxylic acid as a substrate. However, at this time, the conversion rate of fat to long chain alcohol is due to substances that exist as by-products such as ω-hydroxy fatty acid through GC-FID analysis. Thus, the ratio of the by-product to the fatty alcohol and the maximum conversion rate value when using the long-chain hydroxy fatty acid as a substrate for the CAR enzyme were analyzed. As a result of this experiment, a high production amount (76%) of C12 long chain fatty alcohols from C12 long chain fatty acids (12-hydroxydodecanoic acid) was confirmed, and additionally, the substrate specificity of other long chain hydroxy fatty acids was confirmed and the amount of production was analyzed. I did. Specifically, the specificity of the long-chain hydroxyl fatty acid substrate was revealed by analyzing the conversion rates of C10 hydroxy long-chain fatty acids (10-hydroxydecanoic acid) and C16 hydroxyhexadecanoic acid to long-chain fatty alcohols. In particular, in the case of the 12-hydroxydodecanoic acid substrate, it was revealed through the docking simulation results that the CAR enzyme activity was enhanced by hydrogen bonding/charge-charge interaction with the HO- moiety. Since then, the production and activity evaluation of the mutant of the enzyme manipulated the selected key residue is in progress. In addition, the conversion rate of hydroxy long-chain fatty acid substrate to long-chain fatty alcohol according to cell concentration was also evaluated.