신호준 함아정 2021-02 30705 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/20154 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2021. 2 파울러자유아메바는 인체의 코를 통해 침범하여 원발성의 아메바성 뇌수막염을 일으킨다고 알려져 있다. 생활사 중 세 가지 형태의 영양형(trophozoite)과 편모형(flagellate) 그리고 포낭형(cyst)이 있으며, 이 중 감염형인 영양형이 인체 내의 중추 신경계로 들어가 뇌 조직을 파괴하게 된다. 이 때 숙주세포에 아메바가 접촉하고 세포용해물질 등을 분비하며 숙포세포의 세포병변효과를 유도하여 세포사멸을 일으킨다는 보고가 있다. 아메바 세포질의 분출 형태인 food-cups 구조 형성에 관여하며 숙주세포에 부착해 세포의 용해(trogocytosis)를 유발하고 식세포작용을 수반한 접촉성 기전에 관여한다고 알려진 유전자로 Nf-actin 및 nfa1 등이 있다. 특히 Nf-actin 유전자는 분화와 포식작용이 활발한 영양형에서 food-cups 부위에 많이 발현된다고 보고되었으나, 아메바의 포낭형에서 발현되는 유전자에 대한 연구는 미미한 편이다. 앞선 연구에서 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형에서 발현되는 유전자가 분석되었으며 그 결과, 포낭형에서 과발현되는 Nf-profilin 유전자가 클로닝 되었으며, 본 연구에서는 구축된 Nf-profilin 유전자 정보를 이용하여 실험을 수행하였다. RT-PCR 및 real-time RT-PCR, Western blotting 그리고 immuno-cytochemistry를 수행하여 아메바 영양형 및 포낭형에서 Nf-profilin유전자의 발현 차이를 비교하고 파울러자유아메바 내에서의 Nf-profilin 단백질의 발현 위치를 형광 현미경 및 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하고자 하였다. 파울러자유아메바에서 Nf-profilin 유전자는 운동기능과 식세포작용이 일어나지 않는 휴면상태의 포낭형에서 많이 발현되는 것을 알 수 있었으며, 영양형에서는 특이적으로 발현이 감소하였다. 표적세포가 있을 때 Nf-profilin단백질의 발현 변화를 알아보고자 CHO 세포와 혼합배양 하였을 때, 포낭형을 혼합배양한 실험군에서는 아메바 포낭형의 세포질 전체에서 Nf-profilin 단백질이 발현하였다. 반면, Nf-actin 단백질은 파울러자유아메바의 포낭형에서 거의 발현되지 않았다. 혼합배양시간에 따라 점차 영양형으로 변화해갈수록 위족(pseudopodia)과 food-cups 부위에서 Nf-actin 단백질이 나타났으며, 배양 시간에 따라 발현 양이 증가하였는데 특히, 표적세포에 접촉할 때 영양형 형태에서 강한 발현 수준을 보였다. 이는 아메바 영양형이 표적세포에 달라붙는 adhesion 역할과 phagocytosis 작용에 Nf-profilin 유전자는 직접 작용하지는 않는다고 생각된다. 결론적으로 Nf-profilin과 Nf-actin 유전자는 파울러자유아메바 생활사의 영양형과 포낭형에서 각각 대조되는 결과가 관찰되었는데, 아메바의 환경 내 생존과 증식조절에서 중요한 유전자임을 보여주었다. Nf-profilin 유전자에 대한 발현 조절 연구는 파울러자유아메바의 병원성 분석 및 아메바에 의한 감염증 치료제 개발을 위한 기초자료로 활용할 수 있을 것이다. I 서론 1 II 재료 및 방법 9 A. 세포 배양 9 1. 파울러자유아메바(N. fowleri)의 배양 및 포낭형성(encystation) 9 2. CHO 세포(Chinese hamster ovary cell) 배양 10 B. CHO 세포와 파울러자유아메바의 혼합배양 11 1. 혼합배양을 위한 혼합배지 조성 11 2. CHO 세포와 파울러자유아메바의 혼합배양 12 3. 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용 관찰 13 C. 파울러자유아메바의 포낭형성과정에 따른 Nf-profilin 단백질의 발현량 변화 관찰 13 1. RT-PCR을 이용한 파울러자유아메바 Nf-profilin 발현 확인 13 1) RNA 분리 및 cDNA 합성 15 2) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) 시행 16 3) Real-time RT-PCR 시행 16 2. SDS-PAGE 및 Western blotting 시행 18 3. Immunocytochemistry 시행 19 III. 결과 21 A. 파울러자유아메바의 포낭 형성에 따른 Nf-profilin 유전자의 발현량 변화 21 1. 파울러자유아메바의 포낭형성 유도 21 2. Nf-profilin 유전자 발현의 RT-PCR 결과 23 3. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석 25 B. 파울러자유아메바의 영양형 및 포낭형 내 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 27 1. 형광현미경 관찰 결과 27 2. 공초점 레이저 주사현미경 관찰 결과 30 C. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용과 Nf-profilin 유전자 발현 33 1. 혼합배양시간에 따른 파울러자유아메바의 형태학적 변화 33 2. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바 Nf-profilin 유전자의 시간별 발현량 변화 36 1) RT-PCR 결과 36 2) Real-time RT-PCR 결과 38 D. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 40 1. 형광 현미경 관찰 결과 40 2. 공초점 레이저 주사현미경 관찰 결과 47 IV. 고찰 49 V. 결론 56 참고문헌 57 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 병원성 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)에서 발현하는 profilin 단백질의 세포 내 발현 양상 Intracellular localization of profilin protein expressed in pathogenic Naegleria fowleri Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 의생명과학과 2021. 2 Master I804:41038-000000030705 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000030705 Actin Immuno-cytochemistry Profilin 아메바성 뇌수막염 파울러자유아메바