빈범호 백진명 2021-02 30528 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/20115 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :응용생명공학과,2021. 2 니코틴 아마이드 모노뉴클레오타이드(NMN)는 마우스에 장기간 처리시 에너지 및 지질 대사를 증가시키고, 안구 기능과 면역 반응을 개선하며, 인슐린 감수성을 증가시키는 등 다양한 역할을 하는 대표적인 노화 방지 약물이다. 그러나 쥐는 인간과 같이 기저층에 멜라닌 세포가 없기 때문에 노화 진행 중 피부 색소 침착에 대한 NMN의 영향은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 연구에서 멜라닌 생성에 대한 NMN의 효과에 대해 연구하였다. 인간 신생아 멜라닌 세포를 1년 동안 배양하여 복제 노화 멜라닌 세포를 획득하였다. NMN을 젊은 멜라닌 세포와 노화된 멜라닌 세포 모두에 처리하여 멜라닌 색소의 생성을 모니터링하였다. 또한 각 세포의 멜라닌 생성 및 세포 주기 관련 단백질을 Western blot으로 분석하고, mRNA 수준은 genome-wide 및 qPCR을 조합하여 분석하였다. 추가로 재구성된 3차원 인공 피부 모델을 사용하여 멜라닌 생성에 대한 NMN의 효과를 검증했다. NMN은 단기 및 장기 투여에서 젊은 멜라닌 세포에 대한 명백한 영향을 나타내지 않았다. 그러나 노화된 멜라닌 세포에서 감소된 멜라닌 생성은 tyrosinase (TYR)와 같은 멜라닌 색소 생성 관련 단백질들의 발현 변화없이 나타났다. genome-wide 분석은 멜라닌 생성의 상위에 있는 수용체 발현의 감소를 보여주었다. 멜라닌 세포 노화 과정에서 멜라닌 관련 단백질 및 수용체의 발현은 각 계대마다 변했지만, 계대 간의 상관관계는 발견되지 않았다. 이는 자극이나 생물학적 리듬에 따라 각 계대에서 멜라닌 생성 강도가 변할 수 있음을 의미한다. NMN은 멜라닌 생성과 관련된 수용체 신호 전달을 하향 조절함으로써 노화된 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 감소시킨다. 따라서, NMN은 새로운 유형의 멜라닌 생성 억제제이며, 위와 같은 결과들은 노화됨에 따라 발생하는 과다색소 침착 장애를 치료할 수 있는 근거를 제시하고 있다. Ⅰ. 서론 １ Ⅱ. 실험 재료 및 연구 방법 ３ A. 실험 재료 ３ B. 연구 방법 ４ 1. Cell culture ４ 2. Senescence-associated β-galactosidase assay (SA-β-gal) ４ 3. Cell viability ５ 4. Melanin assay ５ 5. Quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) ５ 6. Western blot ６ 7. 3차원 인공 피부 모델 (Human pigmented epidermis model) ７ 8. mRNA sequencing and data analysis ７ 9. Statistical analysis ８ Ⅲ. 결과 ９ A. NMN은 노화된 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 감소시킨다. ９ B. NMN은 멜라닌 생성 관련 수용체 신호 전달에 관여하는 유전자를 하향 조절한다. １０ C. NMN은 멜라닌 생성 관련 수용체 신호 전달을 억제한다. １１ D. NAD+는 멜라닌 생성 수용체 신호를 하향 조절하여 멜라닌 생성을 감소시킨다. １２ E. SLC12A6은 인간 멜라닌 세포에서 추정되는 NMN 수송체이다. １２ Ⅳ. 토론 １４ Ⅴ. 참고문헌 ２４ Abstract ３０ kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 노화 멜라닌 세포에서 Nicotinamide mononucleotide의 멜라닌 생성 억제 효과 연구 Nicotinamide mononucleotide reduces melanin production in aged melanocytes by down-regulating the melanogenesis-related receptor signaling Thesis 아주대학교 일반대학원 Baek Jin-Myoung 일반대학원 응용생명공학과 2021. 2 Master I804:41038-000000030528 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000030528 Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamide mononucleotide SLC12A6 SLC12A8 aging melanin melanogenesis Nicotinamide mononucleotide (NMN) is one of the representative anti-aging drug that, in long-term administrated mice, causes an increase in energy and lipid metabolism, improve eye functions and immune responses, as well as increased insulin sensitivity. However, the effects of NMN on skin pigmentation during aging are still unknown, since mice do not have melanocytes in basal layer as humans do. In this study, we demonstrate the effects of NMN on melanogenesis in human skin. We obtained the replicative senescent (aged) melanocytes from one year-culturing of human neonatal melanocytes. NMN was applied to both young and aged melanocytes, and then melanin production was monitored. In addition, melanogenesis and cell cycle-related proteins in each cell were analyzed by Western blotting, and their mRNA levels were analyzed in combination with genome-wide and qualitative real-time PCR analyses. A reconstituted human skin model was used to validate the effect of NMN on melanogenesis. NMN shows no apparent effects on young melanocytes in short and long-term administration. However, in aged melanocytes, the predominant reduction of melanin production was shown without expressional changes in melanogenesis-related proteins, including tyrosinase, tyrosinase-related proteins and PMEL17. Genome-wide analysis revealed the reduction of receptor expressions that are upstream of melanogenesis. During melanocyte aging, expressions of tyrosinase and melanogenesis-associated receptors change in each passage, but no correlation with passages was found, implying that the strength of melanogenesis is changeable at each passage in response to the stimuli or biological rhythms. NMN reduces melanogenesis in aged melanocytes by down-regulating the melanogenesis-associated receptor signaling. Therefore, NMN is a new type of anti-melanogenic agent, and could be a therapeutic material for aging-related hyperpigmentation disorders.