박상규 백은지 2021-02 30561 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/20010 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :약학과,2021. 2 c-kit/CD117은 receptor tyrosine kinase (RTK)이며, ligand인 줄기세포 성장인자 (SCF; stem cell factor)의 결합으로 특정 유전자의 발현을 유도하고 세포 분화 및 증식 조절 그리고 하위 신호 전달 경로를 활성화해 종양 발생 및 발달 그리고 재발에 핵심적인 역할을 한다. SCF와 c-kit의 신호 전달 경로는 일부 특정 종양과 밀접한 관계가 있으며 특히 위장관 간질 종양 (GIST; gastrointestinal stromal tumor), 급성 골수성 백혈병 (AML; acute myeloid leukemia), 흑색종 (melanoma)과 같은 암에서 과 발현되어 있다고 알려져 있다. c-kit을 표적화하여 개발된 항체는 예후가 좋지 않은 암종의 치료제로서 가능성을 제기한다. 본 연구실에서는 c-kit을 표적하는 인간 단일 클론 항체인 2G4를 개발하였고, c-kit에 대한 2G4의 결합 친화력 및 특이성을 본 연구에서 분석하였다. Mutant c-kit clone을 사용하여 binding site를 indirect ELISA로 확인했으며, competitive ELSIA를 통해 SCF와 c-kit의 결합에 대한 항체의 억제 효과를 확인했다. 또한, c-kit negative cell lysate를 사용하여 면역 침강법과 Western blot, LC-MS/MS 분석을 진행하였으며 c-kit 외에 세포에서 발현하는 막 단백질에 대한 2G4 항체의 off-target binding이 없음을 확인하였다. 따라서, 본 연구실에서 개발된 2G4 항체는 c-kit에 대한 특이적 결합 능을 가지기 때문에 이후 추가적인 연구개발을 통하여 암에 대한 항체 치료제로서 가능성을 제시한다. I. 서론 1 II. 재료 및 방법 7 1. 세포배양 7 2. DNA midi-prep 8 3. 형질주입 (Transfection) 8 4. 투석 (Dialysis) 8 5. Western blot 9 6. Trichloroacetic acid (TCA) 침전법 10 7. 간접 효소면역 측정법 (Indirect ELISA) 11 8. 경쟁 효소면역 측정법 (Competitive ELISA) 12 9. 면역 침강법 (Immunoprecipitation) 13 10. 액체 크로마토그래피 (LC-MS/MS) 14 11. 통계학적 분석 (Statistical analysis) 15 III. 결과 19 1. 2G4에 의한 SCF와 c-kit의 결합 억제 19 2. c-kit에 대한 2G4의 epitope mapping 23 3. c-kit에 대한 2G4의 특이적 결합 30 4. 2G4의 non-specific target binding 32 IV. 고찰 37 V. 결론 41 VI. 참고문헌 42 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. c-kit을 타깃하는 인간 항체인 2G4의 에피토프 맵핑과 비 특이적인 결합 분석 연구 Epitope mapping and non-specific target binding analysis of 2G4, a human antibody targeting c-kit Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 약학과 2021. 2 Master I804:41038-000000030561 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000030561 Antibody ELISA Epitope mapping LC-MS/MS SCF c-kit c-kit/CD117 is a type Ⅲ receptor tyrosine kinase. c-kit is activated by stem cell factor (SCF), which plays a critical role in the regulates cell differentiation and proliferation, activation of growth factor signaling pathways and plays an important role in tumor development and recurrence. The SCF/c-kit signaling pathway is closely related to some specific tumors, especially it is said to be overexpressed in cancers such as gastrointestinal stromal tumor (GIST), acute myeloid leukemia (AML), and melanoma. Thus, c-kit can be a major target marker for a variety of cancers. In this laboratory, 2G4, a human monoclonal antibody targeting c-kit was developed and in this study binding site and characterization of 2G4 to c-kit were analyzed. The binding site was confirmed by indirect ELISA using mutant c-kit clones, and the blocking effect of the antibody on SCF/c-kit binding was confirmed through competitive ELSIA. In addition, Immunoprecipitation and Western blot were performed using c-kit negative cell lysate, and LC-MS/MS analysis was used to show that there was no non-specific target binding of antibodies to membrane proteins expressed in cells other than c-kit. Therefore, 2G4 is an antibody could specifically bind to c-kit, and through further research and development it presents the potential as an antibody treatment for cancers.