이재호 이진삼 2018-02 26806 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/19128 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2018. 2 진핵세포는 다양한 스트레스에 반응하여 세포주기를 조절하는checkpoint를 가지고 있다. 진핵세포의 세포주기에서 이용 가능한 ATP의 양에 따라 2 가지 주요 energy checkpoint를 갖는 것으로 보고되었다. 이 checkpoint는 G1 기 동안 종양 세포주기의 진행과 G2 / M transition의 진행을 조절한다. G1 energy checkpoint에서는 AMPK에 의해 cyclin E가 억제되는 molecular mechanism이 보고되었지만 G2 energy checkpoint는 아직 완전히설명되지 않았다. 본 저자는 G2 기에서 ATP 결핍이 세포주기에 어떤영향을 미치는지 알아보고자 하였다. ATP를 결핍 시키는데 사용한 약물은 glycolysis를 억제하는 2-DG와 mitochondrial Cytochrome C oxidase를 억제하는 NaN3를 사용하였다. Drugs를 처리하였을 때 ATP가 asynchronous 수준으로 떨어지는 것을 확인하였다. 그 다음 mitotic entry와 cyclin B nuclear translocation을 확인한 결과 mitotic entry와 cyclin B nuclear translocation이 차단된 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상이 drugs을 wash out 해 주었을 때 정상수준으로 회복되는지 알아보고자 하였다. 그 결과 drugs를 wash out 했을 때 ATP와 mitotic index가 정상 수준으로 회복하였다. 그 다음 세포주기가 멈추는 현상이 정말로 ATP결핍에 의한 현상인지 알아보고자 또 다른 energy stress를 가해주었다. 2-DG와 mitochondrial complex I 을 억제하는 phenformin을 동시에 처리한 결과 세포주기가 정지되는 것을 확인하였다. 그 다음 glucose free media로 glucose starvation 시켰을 때에도 이러한 현상이 일어나는지 확인하였다. 그 결과 drugs 처리 때보다는 약한정도 였으나 어느정도 세포분열기로의 이행이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 그 다음 세포내 ATP를 측정한 결과 2-DG와 phenformin을 처리하였을 때는 asynchronous 수준으로 떨어지는 것을 확인하였다. 하지만 glucose starvation 조건에서는 ATP가 조금 감소하는 정도였다. 따라서 세포내 ATP의 양에 따라 세포주기가 조절된다는 것을 알 수 있었다. 이러한 현상이 일어나는 기전으로 먼저 AMPK에 의한 것인지 알아보고자 하였다. siRNA와 inhibitor를 사용하여 AMPK를 억제하였지만 세포주기 진행억제가 극복되지 않았다. 따라서 G2 energy checkpoint에서 AMPK는 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 그 다음 DNA 손상에 의한 신호전달 경로를 확인한 결과 Chk1이 인산화 되는 것을 확인하였다. 다양한 inhibitor를 통해 Chk1의 인산화를 억제하였지만 세포주기 진행억제를 극복하지 못했다. 따라서 Chk1도 별다른 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다. 그 다음 ATP가 결핍되었을 때 Wee1 kinase에 의해 인산화 되는 p-Cdk1(Y15)이 줄어들지 않는 것을 확인하였다. Cdk1의 인산화를 조절 하는 Wee1과 Cdc25C의 protein level을 western blot을 통해 확인한 결과 ATP가 결핍되었을 때 protein level이 변화하지 않고 drugs 처리 전 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 따라서 Wee1의 kinase activity를 측정하고자 in vitro kinase assay를 수행하였다. 그 결과 2-DG와 NaN3를 처리하였을 때 Wee1의 kinase activity가 높은 것을 확인하였다. 따라서 ATP를 결핍 시킨 다음 Wee1 inhibitor로 알려진 PD166285를 처리하고 mitotic index와 western blot을 수행한 결과 PCdk1(Y15)가 줄어들고 mitotic entry가 일어나는 것을 확인하였다. 그리고 Time-lapse를 통해서도 확인한 결과 세포주기가 전행 되는 것을 확인하였다. 그런데 Wee1 억제에 의해 mitosis에 들어간 세포들이 mitosis에 세포주기가 멈추는 것을 확인하였다. 세포가 mitosis에 계속 머무르게 되면 세포 사멸이 일어난다는 보고가 있기 때문에 Trypan-blue staining을 통해 cell death를 확인하였다. 그 결과 Wee1 억제를 통해 mitosis로 들어간 세포에서 대부분 세포사멸이 일어나는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 G2 기에서 energy stress가 Wee1에 의한 Cdk1의 억제를 통해 세포주기를 정지시켰음을 시사한다. 나아가 Wee1 억제를 통해 이 세포들이 분열하도록 유도할 수 있는데 이렇게 mitosis로 들어간 세포들은 세포사멸을 일으킨다는 점에서 새로운 항암화학요법의 가능성을 제시한다고 하겠다. Ⅰ. 서론 ................................................................................................................ 1 Ⅱ. 실험재료 및 방법 ........................................................................................ 6 A. 세포배양 ................................................................................................... 6 B. 항체와 시약 ............................................................................................. 6 C. ATP assay .................................................................................................. 6 D. Mitotic index ............................................................................................. 7 E. Immunocytochemistry(ICC) ................................................................... 7 F. 단백질 전기 영동 ................................................................................... 7 G. 면역 침강법 ............................................................................................. 8 H. In vitro kinase assay .................................................................................. 8 I. siRNA ........................................................................................................ 9 J. Time-lapse analysis ................................................................................... 9 K. 통계적 분석 ........................................................................................... 10 Ⅲ. 결과 .............................................................................................................. 11 A. G2 phase 에서 ATP 결핍에 의한 세포주기 정지 확인 ................ 11 B. ATP 결핍에 의한 cyclin B 의 핵으로의 이동억제 확인 ............... 14 C. Energy-stress 가 세포주기에 미치는 영향 ........................................ 17 D. AMPK 가 G2/M transition 에 미치는 영향 ........................................ 22 E. DNA 손상 신호전달 경로에 의한 G2 phase arrest 확인 ............... 25 F. ATP 결핍이 Wee1 과 Cdc25C 에 미치는 영향 ............................. 28 G. Wee1 의 억제를 통한 G2-M transition 확인 ..................................... 31 H. Wee1 의 억제를 통해 mitosis 로 들어간 세포의 운명 확인 ........ 35 Ⅳ. 고찰 .............................................................................................................. 39 Ⅴ. 결론 .............................................................................................................. 42 참고 문헌 ........................................................................................................... 44 ABSTRACT ........................................................................................................ 48 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. G2 기에서 ATP 결핍이 세포분열 개시에 미치는 영향 Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 의생명과학과 2018. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000026806 ATP depletion Cdk1 Wee1