신호준 성기상 2016-08 22891 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/18909 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2016. 8 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는 원발성 아메바성 수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis; PAM)을 일으키는 병원체이다. 파울러자유아메바의 사람이나 실험 동물에 감염은 아메바가 오염된 물에서 물놀이 혹은 수중활동을 할 때 비강내로 아메바 영양형이 유입될 때 일어난다. 파울러자유아메바의 병인기전으로는 숙주세포와 접촉하여 사멸에 이르게 하는 접촉성 병인기작과 여러가지 단백분해효소를 분비하여 숙주세포에 영향을 주는 비접촉성 병인기작으로 알려져 있다. 파울러자유아메바의 시스테인 단백분해효소계열인 Cathepsin B (NfCPB) 및 Cathepsin B-Like (NfCPB-L) 단백질이 클로닝 되었고, 이들의 유전자 크기는 각각 1,038 bp (345개 아미노산) 및 939 bp (313개 아미노산)이다. 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질은 각각 38.4 kDa과 34 kDa의 분자량을 갖고 있으며, 숙주의 조직침투, 면역회피와 영양분흡수에 관련이 있다고 보고되었다. 본 연구는 파울러자유아메바에서 NfCPB와 NfCPB-L 단백질의 분자 면역학적 특성을 관찰하기 위하여 단클론항체를 생산하고자 하였다. 먼저 재조합 NfCPB 및 NfCPB-L 단백질을 얻은 후 마우스에 2주 간격으로 3번 면역시키고, 혈청을 얻어서 ELISA를 통해 항체가(titre)가 높아진 것을 확인하였다. 면역된 마우스의 비장(spleen)을 적출하여 비장세포들을 얻고 myeloma cell line인 F/0 세포들과 세포융합기술(cell fusion)을 통해 잡종세포(hybridoma cell)를 얻었다. 항체가가 높은 클론을 선택하여 제한개수희석법(limiting dilution)을 통하여 단클론세포주(monoclone)를 얻었다. 항-NfCPB 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 7개를 얻었고, 항-NfCPB-L 단클론항체를 분비하는 단클론세포주 3개를 얻었다. 이 중 항체가가 높은 단클론 세포주를 각각 한 개씩 즉, 2C9 (항-NfCPB)과 1C8 (항-NfCPB-L)선택하여 마우스의 복강에 주입하여 복수를 얻었고 정제하여 대량의 단클론항체를 얻었다. 각 항원에 대한 western blot을 시행한 결과, 2C9 단클론항체는 파울러자유아메바의 전체세포 추출물(lysate)과 재조합 NfCPB 단백질에서 각각 28 kDa, 38.4 kDa에서 반응하였으며, 1C8 단클론항체는 파울러자유아메바의 전체세포추출물과 재조합 NfCPB-L 단백질에서 각각 24 kDa과 34 kDa에서 반응하였다. 또한, 종 특이성(species-specific)을 확인하기 위하여 파울러자유아메바(N. fowleri), 그루버자유아메바(N. gruberi), 카스텔란가시아메바 (Acanth-amoeba castellanii), 대식가시아메바(A. polyphaga)의 전체세포 추출물과 2C9과 1C8을 이용하여 각각 western blot을 시행한 결과, 파울러자유아메바 이외의 다른 종의 아메바에서는 반응하지 않았다. Immunocytochemistry assay를 통해 파울러자유아메바 세포내에서 NfCPB와 NfCPB-L 발현위치를 관찰한 결과, 대체로 세포질 전체에서 분포하고 있었으며 특히, 위족(psudophodia)과 food-cup에 많이 분포하고 있었다. 본 연구결과, 2C9와 1C8 단클론항체는 파울러자유아메바를 면역학적으로 연구하는데 유용하게 사용될 것으로 생각된다. I. 서론 1 1) 파울러자유아메바(Naegleria fowleri) 1 2) 원발성 아메바성 수막뇌염(PAM) 1 3) 파울러자유아메바의 병인기전 2 4) 시스테인 단백분해효소(Cysteine protease) 4 5) NfCPB 및 NfCPB-L 단백질 4 6) 연구의 목적 5 II. 재료 및 방법 6 1) 자유아메바의 배양 및 전체추출물 준비 6 2) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질 생산 6 3) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질의 마우스 면역 7 4) 효소면역측정법(ELISA) 7 5) 세포융합(cell fusion) 8 A. 마우스의 비장세포준비 8 B. Myeloma세포의 배양 9 C. 세포융합(cell fusion) 9 6) 단클론항체를 생산하는 세포군 선택 10 7) 단클론항체의 대량생산 및 정제 10 8) 단클론항체의 isotyping 11 9) 항원성 검정을 위한 SDS-PAGE 와 Western blot 시행 11 10) Immunocytochemistry 시행 12 III. 결과 13 1) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질 생산 13 2) 재조합 NfCPB와 NfCPB-L단백질에 대한 단글론항체의 생산 15 A. 재조합 NfCPB와 NfCPB-L 단백질의 마우스 면역 15 B. 잡종세포주에서 항-NfCPB 항체와 항-NfCPB-L 항체 분비확인 17 C. 단클론세포주에서 항-NfCPB 항체와 항-NfCPB-L 항체 분비확인 19 3) 항-NfCPB 단클론항체와 항-NfCPB-L 단클론항체의 isotype 21 4) 2C9(항-NfCPB)와 1C8(항-NfCPB-L) 단클론항체의 항원성 23 5) 2C9(항-NfCPB)와 1C8(항-NfCPB-L) 단클론항체의 종특이성 25 6) 2C9(항-NfCPB)와 1C8(항-NfCPB-L) 단클론항체의 Immunocytochemistry assay 결과 27 IV. 고찰 29 V. 결론 33 참고문헌 34 ABSTRACT 38 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 파울러자유아메바 Cathepsin B 및 Cathepsin B-Like 단백질에 대한 단클론항체의 생산과 특성규명 Production and characterization of monoclonal antibodies against cathepsin B and cathepsin B-Like proteins of Naegleria fowleri Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 의생명과학과 2016. 8 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000022891 파울러자유아메바 단클론항체 Cathepsin B 단백질 Cathepsin B-Like 단백질