김경민 김주미 2015-02 19519 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/18548 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2015. 2 B형간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)는 Hepadnaviridae family에 속하며, genome 크기가 약 3.2kb의 작은 DNA 바이러스이다. 전 세계적으로 약 3억 5천만 명 이상이 만성으로 HBV에 감염되어 있다. HBV는 급성과 만성 B형 간염을 일으키며 만성 B형 간염 환자는 간경변이나 간암으로 발전할 가능성이 높다. AMP-activated protein kinase(AMPK)는 ATP 소비와 생성의 균형을 위해서 필요한 에너지 센서 단백질이다. Hepatitis C virus(HCV)의 증식을 위해서는 AMPK의 억제와mammalian target of rapamycin(mTOR)의 활성이 필요하며 이를 통해 바이러스 복제에 필요한 지질을 합성한다. HBV X 단백질(HBx)은 mTOR의 활성을 증가시켜 hepatocellular carcinoma(HCC) 세포의 증식을 유도한다. 본 연구에서는 HBV가 증식할 때 AMPK와 mTOR의 활성에 변화가 있는지 알아보았고, AMPK-mTOR 신호전달 과정의 변화가 HBV 증식에 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. HCC 세포인 HepG2세포에서 유래한 HBV 가 증식하는 HepG2.2.15세포, PEB 세포와 Huh7세포에서 유래한 HBV 가 증식하는 Huh7 HBV WT stable 세포에서 AMPK의 발현과 인산화를 조사한 결과 세 가지 세포에서 AMPK의 인산화가 감소한 것을 밝혀냈다. HepG2.2.15세포, PEB세포와 Huh7 HBV WT stable 세포에서 mTOR 발현과 인산화가 증가하였다. HepG2.2.15 세포에서 AMPK의 인산화가 감소하였음에도 불구하고 regulatory-associated protein of mTOR(Raptor)와 tuberous sclerosis 2(TSC2)의 인산화는 증가하였다. HepG2.2.15세포에서 Akt 발현과 인산화가 증가하였다. Protein phosphatase 2A(PP2A), S6 kinase 1(S6K1)와 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1(4E-BP1)의 발현과 인산화는 HepG2.2.15세포에서 증가하였다. Huh7 HBV WT stable 세포에서는 S6K1의 인산화, PP2A의 발현과 인산화가 증가하였다. AMPK alpha 2가 과발현 될 때 HBV의 core particle과 그 속의 핵산, HBV의 DNA가 감소하였다. HepG2.2.15 세포에 metformin을 처리하였을 때 AMPK의 인산화는 증가하였고 이에 따라Akt, mTOR, PP2A, S6K1 와 4E-BP1의 인산화도 줄어들었다. 그렇기 때문에 mTOR, Akt, PP2A, S6K1과 4E-BP1는 AMPK의 downstream으로 추정되었다. Rapamycin에 의해 HepG2.2.15 세포에서 mTOR의 인산화가 억제되었고 S6K1의 인산화 또한 감소되었다. 그리고 Akt의 인산화는 감소하였고 AMPK의 인산화는 증가하였다. 앞으로 Akt, mTOR, S6K1과 PP2A의 억제제를 처리함으로써 AMPK의 upstream과 mTOR의 downstream을 밝혀낼 것이다. 국문요약 ⅰ 차례 ⅲ 그림차례 ⅴ Ⅰ. 서론 1 A. B형간염 바이러스 1 B. B형간염 바이러스 증식 2 C. AMPK 신호전달 과정 3 D. 연구목적 5 Ⅱ. 재료 및 방법 7 A. 세포 배양 7 B. HBV가 증식하는 stable 세포 구축 7 C. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE) electrophoresis 8 D. Western blotting 9 E. Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) 10 F. HBV core particle 분석 12 G. HBV DNA 확인을 위한 Southern blotting 13 H. 억제제 혹은 활성제 처리에 의한 HBV 증식 변화 14 I. AMPK 과발현 벡터 제작 14 Ⅲ. 결과 16 A. HBV 증식 세포에서의 AMPK와 mTOR 발현 및 인산화 변화 16 B. HBV 증식 세포에서의 Raptor와 TSC2 발현 및 인산화 변화 18 C. HBV 증식 세포에서 Akt의 발현 및 인산화 변화 20 D. HBV 증식 세포에서 PP2A, S6K1과 4E-BP1 발현 및 인산화 변화 22 E. AMPK 과발현에 의한 AMPK 의 변화가 HBV증식에 미치는 영향 24 F. Metformin에 의한 AMPK-mTOR 신호전달 과정의 변화 26 G. Rapamycin에 의한 AMPK-mTOR 신호전달 과정의 변화 28 Ⅳ. 고찰 30 Ⅴ. 결론 32 참고문헌 34 ABSTRACT 44 그림 차례 Fig. 1. Phosphorylation of AMPK was down-regulated and phosphorylation and expression of mTOR were up-regulated in HBV replicating stable cells 17 Fig. 2. Phosphorylations of Raptor and TSC2 were up-regulated in HBV replicating stable cells 19 Fig. 3. Akt activation was up-regulated in HepG2-derived in HBV replicating stable cells 21 Fig. 4. Phosphorylations and expressions of PP2A, S6K1 and 4E-BP1 were up-regulated in HBV replicating stable cells 23 Fig. 5. Effects of AMPK overexpression on AMPK-mTOR signaling and HBV replication 25 Fig. 6. Effect of metformin, an AMPK activator, on AMPK-mTOR signaling pathway 27 Fig. 7. Effect of rapamycin, a mTOR inhibitor, on AMPK-mTOR signaling pathway 29 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. AMP-activated protein kinase-mTOR 신호전달 과정이 B형 간염 바이러스 증식에 미치는 영향 Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 의생명과학과 2015. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000019519 HBV AMPK-mTOR signal Akt PP2A S6K1 4E-BP1 B형간염 바이러스 AMPK-mTOR 신호 전달과정