서영호 최지희 2014-08 17404 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/18441 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명학과,2014. 8 수모화 (SUMOylation)반응은 단백질의 기능을 조절하여 생물체의 기능을 다양화시키는 전사 후 변형 (post-translational modification)의 한 종류로 수모(SUMO) 단백질이 기질 단백질에 결합하여 수모화 반응이 일어난 기질 단백질의 기능을 변화시키는 역할을 한다. 시냅스에서 수모화 반응이 일어나게 되면 시냅스 형성, axonal mRNA 수송, 이온채널 활성도, 수용체의 세포내 유입이 조절된다. 시냅스에서 수모화 반응에 의해 수용체가 조절하여 시냅스를 조절한다는 보고가 많이 있지만 특히 최근에 흥분성 시냅스를 조절하는 수용체인 metabotropic glutamate receptor 7 (mGluR7) 수용체의 수모화 반응에 대한 연구가 진행되고 있다. 이전 보고들에 의하면 mGluR7 수용체의 수모화 반응은 mGluR7 C-말단의 라이신 889잔기에서 일어난다고 밝혀졌다. 하지만 in vivo 상태에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는 것의 여부는 아직 불분명한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 full-length mGluR7 수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는지에 대한 여부를 확인하고 뉴런세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응을 확인하고자 하였다. 먼저 full-length mGluR7 수용체의 수모화 반응을 확인하기 위해 HEK293T 세포에 수모 단백질과 full-length mGluR7 수용체를 같이 형질주입하여 면역침강법과 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 그 결과 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는 것을 발견하였다. 이와 함께 mGluR7 수용체가 SUMO-1 및 SUMO-2/3에 의해 수모화 반응이 일어나는 것을 확인하였다. 또한 신경세포와 대뇌조직에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는지 확인하기 위해 면역침강법과 웨스턴 블로팅을 수행하여 mGluR7 수용체의 수모화 반응을 확인하였다. 또한, mGluR7 수용체의 수모화 반응의 역할을 조사하기 위하여 신경세포에 mGluR group III 수용체의 agonist인 L-AP4를 처리하여 mGluR7 수용체의 수모화 반응의 변화를 확인하였다. 그 결과 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 L-AP4에 의해 감소되는 것을 발견하였다. 이와 함께 신경세포에 mGluR7 과 mGluR7K889R을 과발현시킨 다음 L-AP4를 처리하여 탈수모화 반응을 유도한 후, 공초점 형광현미경을 통하여 mGluR7 수용체의 trafficking의 변화를 관찰하였다. 그 결과, L-AP4에 의해 mGluR7 수용체가 세포내로 유입되는 양이 증가하는 것을 발견하였다. 또한, mGluR7 수용체 수모화 반응이 mGluR7 수용체의 trafficking을 조절하는 인산화 반응과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, mGluR7을 과발현시킨 HEK293T 세포에 PMA 약물을 이용해 인산화 반응을 활성화시킨 후 mGluR7 수용체의 수모화 반응의 변화를 조사하였다. 그 결과, mGluR7 수용체의 인산화 반응을 유도했을 때 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 증가하는 것을 발견하여 mGluR7 수용체의 인산화 반응이 mGluR7 수용체의 수모화 반응을 유도하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과로, mGluR7 수용체의 수모화 반응이 mGluR7 수용체의 trafficking을 조절하는 것을 확인하였다. 차 례 국문요약 ⅰ 차례 ⅲ 그림 차례 ⅴ 약어 ⅵ Ⅰ. 서론 1 A. 신경세포 1 B. 글루타메이트 수용체 1 C. mGluR7 수용체 2 D. 전사 후 변형과정 3 E. 수모화 반응 4 F. 실험 목적 5 Ⅱ. 재료 및 방법 8 A. 시약및 항체 8 B. 세포 배양 8 C. 형질주입 9 D. 면역 침강법 9 E. 웨스턴 블로팅 10 F. Internalization assay 11 Ⅲ. 결과 12 A. mGluR7 수용체 C-말단의 라이신 889잔기에서 수모화 반응이 일어남 12 B. SENP-1 에 의한 mGluR7 수용체의 수모화 반응 억제 16 C. 대뇌조직에서 일어나는 mGluR7 수용체의 수모화 반응 18 D. L-AP4 에 의해 유도되는 mGluR7 수용체의 탈수모화 반응 20 E. mGluR7 수용체의 탈수모화 반응에 의한 trafficking 조절 23 F. mGluR7 수용체의 인산화 반응과 수모화 반응 25 Ⅳ. 고찰 27 Ⅴ. 결론 30 참고문헌 31 ABSTRACT 37 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 시냅스에서 수모화에 의한 글루타메이트 수용체 mGluR7의 trafficking 조절 Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 의생명과학과 2014. 8 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000017404 시냅스 수모화 글루타메이트수용체