백은주 Chung, Jee-In 2013-02 13823 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/18178 학위논문(박사)아주대학교 일반대학원 :의생명학과,2013. 2 Cyclooxygenase (COX)는 prostaglandin (PG) 합성에 매우 중요한 효소이며 전체 반응의 속도를 제한하는 효소이다. COX-2와 그의 생성물인 PG는 말초에서 주로 염증조절인자로서 작용하여 cytokine, chemokine, 세포부착분자의 발현을 조절한다. 또 중추신경계에서는 퇴행성뇌질환에 의해 증가하여 세포사멸과 염증, seizure 발작을 조절한다. 전통적으로 COXs는 염증과 관련하여 통증과 발열을 유발하기 때문에 비스테로이드성항염증제 (NSAIDs)의 표적으로 이용되고 있다. 비스테로이드성항염증제는 일반인도 처방없이 쉽게 접근할수 있고 널리 사용되고 있지만 떄로 NSAIDs의 오남용은 궤양이나 심혈관계 질환 등의 심각한 부작용을 부를수 있다. 또 앞에서 언급한바와 같이 중추와 말초에서 COX-2의 주요 역할이 다르기 때문에 NSAIDs의 사용에 좀더 주의를 기울일 필요가 있다. 본 연구에서는 중추와 말초에서 COX-2의 서로 다른 역할을 밝히고 COX-2의 활성억제 약물을 이용한 질병의 통제에 좀 더 정확하고 새로운 정보를 제공하고자 한다. Part I에서는 COX의 생성물중 하나인 PGF2가 신생쥐의 뇌에 항경련작용을 보임을 밝히고, COX activity가 신생아의 seizure에 대한 민감성의 원인이 됨을 입증하였다. 생후9일의 신생쥐는 성체쥐 (생후 35일)보다 KA의 투여로 seizure를 유도했을 때 더 쉽게, 더 극심한 수준의 seizure가 발생하고, 이때 COX억제제는 성체쥐의 seizure activity는 증가시키지만 신생쥐는 낮은 COX activity로 인해 증가시키지 않았다. 흥미롭게도 COXs mRNA와 단백질은 나이 의존적으로 증가하는데, 신생쥐의 경우 전체 COX-1 과 COX-2 발현이 성체쥐보다 적을 뿐만 아니라 glycosylation된 COX는 거의 없고 unglycosylation된 COXs만 발현한다. Glycosylation은 COXs의 효소활성에 필수적이므로 신생쥐는 seizure유무와 관계없이 COX-2 activity가 매우 낮아 PGF2가 거의 합성되지 못한다. 반면 성체쥐는 glycosylation된 COXs를 발현하고 seizure에 의해 COX-2와 PGF2가 증가한다. 마지막으로 PGF2의 intracisternal space로의 투여는 신생쥐의 극심한 seizure activity를 감소시킨다. 이같은 사실들로 바탕으로 낮은 COX activity가 신생쥐의 seizure에 대한 과도한 민감성의 한 원인이며 PGF2 와 COX-2는 신생아에 있어 항경련제로 작용할수 있음을 증명하였다. Part II에서는 말초의 염증질환 중 하나인 관절염에서 COX-2의 역할을 밝혔다. 본 연구에서 저강도초음파를 이용한 치료에 관절염의 해소가 COX-2와 관련되어있음을 입증하였다. Complete Freund’s adjuvant (CFA)로 유도한 관절염 모델에서 저강도초음파는 무릎부종뿐만 아니라 TNF-a를 제외한 COX-1/2, IL-1b, iNOS, CCR5등의 염증매개인자를 감소시켰다. 그리고 이들 염증매개인자들은 COX-2와 매우 강한 상관관계를 보였다. CFA는 또한 활막으로 면역세포들의 침투를 증가시켰는데 이들 염증세포는 모두 COX-2를 발현하였다. 관절염 유발 3일째 meyloperosidase (MPO)양성의 neutrophil이 먼저 침투하여 핵을 이루고 주변부를 Iba-1 양성의 macrophage가 감싸고 있는데, 5일째에는 macrophage가 핵 부의를 대체하였다. 저강도 초음파는 neurophil과 macrophage를 모두 감소시킬뿐만 아니라 COX-2의 발현 역시 감소시킨다. 이러한 결과는 COX-2가 면역세포의 침투와 매우 밀접하게 연관되어있음을 시사한다. 앞의 두 결과를 종합해보면, COX-2의 억제는 중추신경계에서는 경련성 신경 활성을 증진시켜 질병을 악화시키고, 말초에서는 항염증효과를 나타내 염증질환을 해소시킨다. 이와 같은 COX-2의 상반된 역할에 대한 고찰은 NSAIDs의 투여에 있어 질병과 나이를 고려하여 좀 더 명확하고 구체적인 방법이 요구됨을 시사한다. ABSTRACT i TABLE OF CONTENTS iii LIST OF FIGURES v LIST OF TABLES vii I. INTRODUCTION 1 1. Cyclooxygenses 1 2. COX-2 in neurodegenerative disease 2 3. COX-2 in inflammatory disease 4 II. MATERIALS AND METHODS 7 1. Cell culture 7 1.1. Mixed cortical neuron 7 1.2. BV2 microglial cell 7 2. Seizure induction and drug administration 7 3. Measurement of seizure activity 8 4. Induction of arthritis and ultrasound exposure 8 5. Measurement of knee circumference 9 6. Tissue preparation 9 7. Total RNA isolation 10 8. Quantitative Real time PCR analysis 10 9. Semi-quantitative reverse transcriptase PCR 11 10. SDS-PAGE and western blot analysis 13 11. Deglycosylation 14 12. Immunohistochemistry 14 13. Prostaglandin measurement 14 14. Statistical analysis 15 III. RESUTLS 16 Part I. Role of Cyclooxygenase in brain disease 16 1.1. High seizure susceptibility in developing brain 16 1.2. Involvement of Seizure susceptibility and COX activity 18 1.3. Mortality of neonate and adult in KA-induced seizure 20 1.4. KA-increased COX-2 activity 22 1.5. COX-2 increased in adult hippocampal neuron 26 1.6. Developmentally regulated COX expression 29 1.7. Age-related COX-2 N-glycosylation regulated enzyme activity 33 1.8. PGES and PGFS expression during brain development 35 1.9. Anti-convulsive effect of PGF2 37 Part II. Role of cyclooxygenase in peripheral disease: inflammatory arthritis 39 2.1. Effect of LIUS on knee edema 39 2.2. Effect of LIUS on COXs and cytokines 42 2.3. Effect of LIUS on COXs, iNOS and CD11b 45 2.4. Effect of LIUS on chemoattractant molecules 48 2.5. Effect of LIUS on immune cells recruitment 50 2.6. COX-2 is related with immune cell infiltration 54 IV. DISCUSSION 57 V. REFERENCES 65 국문초록 79 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Diverse roles of cyclooxygenase in the central nervous system and the periphery 정지인 Thesis 아주대학교 일반대학원 정지인 일반대학원 의생명과학과 2013. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000013823 Cyclooxygenase PGF2α Seizure Neonate Arthritis NSAID Synovium Immune cell infiltration Cyclooxygenase (COX) is a rate limiting enzyme for prostaglandin (PG) synthesis. As inflammatory mediator, COX-2 and its product PGs modulate cytokines, chemokines and adhesion molecules in periphery and central nervous system. In the brain, COX-2 is increased by neurodegenerative disease and regulates cell death or seizure activity. In this study, I investigated that differential role of COX-2 in CNS and peripheral disease. In part I, I demonstrated that COX activity was closely involved with neonatal seizure susceptibility, and PGF2α act as anticonvulsant in neonatal brain. In present study, mouse neonate (post-natal day 9; P9) are far more prone to KA-induced seizures than the adult (P35). The seizure activities in the adult, which were aggravated by COX inhibition, showed less than those in the neonate. However, the neonatal seizure was not affected by COX inhibition which caused by little COX activity. Interestingly, in the brain, COXs mRNA and protein were age dependently increased. Neonatal brain mainly expressed unglycosylated COXs and little glycosylated COXs. Because of glycosylation is necessary for COXs enzyme activity, neonate just released little PGF2α and it does not affected by seizure. While in Adult, brain expressed glycosylated COXs and seizure increased COX-2 and PGF2α. Intracisteral PGF2α administration reduced excessive neonatal seizure activity. Taken together, little COX activity is one of the causes which are the susceptibility of neonatal seizure. And PGF2a and COX-2 act as anticonvulsant in neonate. In Part II, I demonstrate role of COX-2 as a therapeutic target in knee arthritis. Arthritis with intra-articular inflammation was accompanied by joint pain, swelling, and stiffness leading to significant functional impairment. Thus, regulation of joint inflammation is a good therapeutic approach for patients with arthritis. COX-2 and prostaglandin is well known inflammatory mediator which regulate cytokine and chemokine with cyclic feedback. In this study, using low intensity ultrasound (LIUS), I demonstrated relevance of COX-2 to arthritis resolution. Complete Freund’s adjuvant (CFA)-induced edema and synovial membrane hyperplasia in the ipsilateral joint were diminished by LIUS. The inflammatory mediators, COX-1/2, IL-1β, iNOS and chemoattractant moleculs but not TNF-α, in the synovial membrane were induced after three days. And they were reduced by LIUS. COX-2 is strongly correlated with the chemoattractant molecules, CCL2, CCR1, CCR5 and CXCR1, and CD11b induction. On immunohistochemical analysis, CFA increased infiltration of CD11b-positive cells in the synovium which was co-localized with COX-2. After three days, neutrophils, myeloperoxidase (MPO)-positive cells filled the inflammatory core; later, monocytes and macrophages, ionized calcium binding adaptor molecule 1 (Iba-1)-positive cells in the periphery infiltrated the core by day five. LIUS markedly reduced CFA-induced inflammatory cells infiltration. These data suggest COX-2 was closely related with edema and immune cell infiltration by pro-inflammatory mediator. And LIUS showed a potent anti-inflammatory effect in this animal arthritis model through COX-2 suppression.