임인경 김은영 2011-08 11837 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/18055 학위논문(석사)아주대학교 일반대학원 :의생명학과,2011. 8 일반적으로 Cellular senescence란 시간이 지나면 자연적으로 세포 증식이 억제되고 세포내 항상성 유지가 어렵게 되는 것을 말한다. 이러한 cellular senescence는 tumour cell에서도 일어나는데 tumour cell에서의 senescence는 그 결과가 tumour-suppression 으로서도 작용하지만 tumour-promotion 으로서도 작용되어질 수 있다고 알려져 있다. 본 연구에서 사용한 유전자인 TIS21은 TPA에 의해 유도되어지는 21번째 sequences로서 anti-proliferative family에 속하는 단백질이다. 이 유전자는 mouse에서는 TIS21(TPA inducible sequences 21), human에서는 BTG2(B-cell translocation gene-2), rat에서는 PC3(pheocromocytoma clone-3)로 존재하는 동등 유전자이다. TIS21는 세포내의 전사 보조 인자, 신경세포 분화인자 및 성장억제인자로서 thymocyte 의 stage-specific expansion 을 매개하는 중요인자이고 조혈모세포 증식억제인자로 보고된 바 있다. 이 외에도TIS21은 암 억제, 세포사멸(Apoptosis), cell cycle 조절인자, DNA 수복 조절인자, transcriptional co-regulator, 배아세포의 분화 기작 조절인자로서의 기능을 가지고 있다. 본 연구에서 주목한 TIS21의 기능은 TIS21이 cell cycle 조절인자들을 조절함으로서 세포의 노화에 관여하고 있다는 점이다. 정상 세포에서 TIS21과 동등유전자인 BTG2가 세포노화를 유도한다는 사실에 기반을 두어 암세포에서의 TIS21의 역할을 규명하고자 본 연구를 진행하게 되었다. 암세포의 세포노화환경을 만들고자 사용한 Doxorubicin은 대표적인 anti-cancer drug로서 DNA 염기서열에 직접적으로 삽입되어 α-helix구조의 변형을 초래하여 DNA damage를 일으킨다고 알려져 있다. Doxorubicin은 농도에 따라 세포노화를 일으키거나 세포사멸을 일으킬 수 있다. 저농도의 Doxorubicin은 세포노화를 유도할 수 있지만 Doxorubicin에 의해 유도되는 노화기전은 아직 정확히 규명되지 않았다. 본 연구에서 간암세포주인 Huh7 에 저농도의 doxorubicin을 이용하여 유도되어진 세포노화현상에 anti-proliferative gene 인 TIS21이 미치는 효과를 확인하였다. Huh7 세포에서 TIS21단독으로는 세포노화 과정에 관여하지만 흥미롭게도 Doxorubicin을 이용해 노화를 유도한 Huh7 간암세포에서는 오히려 Doxorubicin에 의해 유도되어지는 노화를 억제하는 결과를 보여주었다. 이를 몇 가지 대표적인 노화 표지들을 이용하여 실험하였다. 먼저 TIS21을 단독으로 발현시켰을 경우 control에 비해 SA-β-galactosidase 활성도가 미약하게 증가하였고, proliferation이 억제되었으며 , actin filament가 가늘어지고 끊어지는 현상이 관찰되었다. 이와는 반대로 doxorubicin으로 노화를 유도한 간암세포에 TIS21을 과발현 시킨 경우 SA-β-galactosidase 활성도가 떨어졌고, doxorubicin에 의해 유도되어지는 actin filament의 remodeling이 감소하였으며, doxorubicin에 의한 세포 내 활성산소 (ROS)의 발생이 억제되었다. 이러한 결과들을 토대로, TIS21단독으로는 간암세포의 노화에 주된 역할을 하기엔 역부족이지만 간암세포노화과정에 기여하고, anti-cancer drug인 doxorubicin에 의해 유도되어지는 간암세포노화에서 TIS21은 doxorubicin에 의해 유도되어지는 간암세포의 노화를 억제한다고 생각되어진다. 또한 이를 short-hairpin RNA를 이용하여 TIS21의 발현을 Knockdown 시켜 이를 확인하는 단계를 진행 중이다. 이러한 이유로 TIS21 발현에 의한 Huh7 간암세포의 노화 조절을 규명하고자 하였다. 핵심어: TIS21, doxorubicin, 세포노화유도, Huh7 , shRNA 국문요약 ⅰ 차례 ⅲ 그림 차례 Ⅴ Ⅰ. 서론 1 A. 세포노화 1 B. TIS21 2 Ⅱ. 재료 및 방법(혹은 연구대상 및 방법) 5 A. 세포 주 및 세포배양 5 B. 세포 수 집계 (Cell number counting) 5 C. TIS21 adenovirus (Ad) 5 D. Senescence associated-β-galactosidase (SA-β-gal) assay 5 E. 면역형광세포염색 (Immunocytochemistry) 6 F. Western blot analysis 6 G. 세포 내 활성산소 (ROS)의 양 측정 7 H. Doxorubicin-induced senescence 7 I. RNA분리와 RT-PCR 7 J. Lentivirus를 이용한 shTIS21 제작 8 Ⅲ. 결과 9 Part 1. TIS21 induces senescence of Huh7 cells and reversal of senescence phenotype by shTIS21 in Huh7 cells with TIS21 A. TIS21에 의한 Huh7 세포에서의 세포증식 억제 9 B. TIS21에 의한 Huh7 세포에서의 SA-β-galactosidase 활성도 증가 9 C. Huh7 세포내 actin filament 분포에서의 TIS21의역할 9 D. Lentivirus를 이용한 shTIS21 제작 10 E. shTIS21 에 의한 세포증식 복구 10 F. shTIS21 에 의한 F-actin의 형태와 위치 복구 10 G. TIS21에 의한 Huh7 세포노화 유도 가설도 11 Part 2. Effect of TIS21 on the senescence of Huh7 cells by treatment with doxorubicin A. Huh7세포에서 Doxorubicin을 이용한 노화 유도 19 B. Doxorubicin-induced senescence Huh7 세포에서의 TIS21의역할 19 C. TIS21을 과 발현시킨 doxorubicin-induced senescence Huh7 세포에서의 F-actin의 형태와 위치 변화 19 D. Huh7세포에서 doxorubicin에 의한 활성산소 발생으로의 세포노화유도와 NAC를 이용한 Doxorubicin-induced ROS 발생억제 확인 20 E. Doxorubicin에 의해 유도된 세포내 활성산소(ROS) 발생 과정에서의 TIS21에 의한 ROS 발생 억제 21 F. Doxorubicin을 전처리 한후 TIS21과발현 시킨 경우 doxorubicin에 의해 유도 노화된 Huh7 세포에서의 TIS21의 역할 21 G. Doxorubicin에 의해 유도 노화된 Huh7세포에서의 TIS21의 역할 가설도 21 Ⅳ. 고찰 32 Ⅴ. 결론 35 참고문헌 36 ABSTRACT 42 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. TIS21 발현에 의한 Huh7 간암세포주의 노화 조절 연구 En Young Kim. Thesis 아주대학교 일반대학원 En Young Kim. 일반대학원 의생명과학과 2011. 8 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000011837 TIS21 doxorubicin 세포노화유도 Huh7 shRNA