조은혜, 곽병주 Jeon, Jeong Wook 2012-08 12743 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/17961 학위논문(박사)아주대학교 일반대학원 :신경과학기술과정,2012. 8 선조체 NADPH-d(+) 신경세포와 운동신경세포의 산화 스트레스에 대한 반응성에 관한 연구 아주대학교 대학원 신경과학기술과정 전 정 욱 (지도교수: 곽 병 주, 조 은 혜) 자유 라디칼에 의한 산화적 스테레스에 대하여 선조체 부위의 NADPH-daiphorase를 발현하는 신경세포는 선택적 세포 사멸을 보여주는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 선조체 세포배양 및 in vivo 모델을 통하여 NADPH-d(+) 신경세포가 산화 스트레스에 대하여 어떻게 선택적 세포사멸을 가지는 지 이에 대한 기전 연구를 항산화효소에 대한 관점에서 진행하였다. 흰쥐의 선조체 세포배양과 in vivo 모델을 통하여 NADPH-d(+) 신경세포가 인위적으로 산화 스트레스를 주었을 때 선택적 세포사멸 저항성을 가지는 것을 확인하였으며, 특히 NADPH-d(-) 신경세포와 비교시 상대적으로 미토콘드리아에서 생성되는 활성산소종이 감소하였다. 그리하여 NADPH-d(+) 신경세포가 가지고 있는 다양한 항산화효소의 mRNA 수준을 확인해본 결과 NADPH-d(-) 신경세포에 비해 MnSOD, glutathione peroxidase 항산화효소의 mRNA 수준이 상대적으로 높게 발현되었다. 이를 통해 미토콘드리아에서 처음 생성되는 슈퍼록사이드 (O2-)를 덜 해로운 과산화수소 (H2O2)로 만드는 MnSOD 활성에 의해 1차적으로 세포사멸에 대한 저항성을 부여해주며, 인위적으로 철 (Fe)에 의한 산화 스트레스를 유발하였을 때 과산화수소 (H2O2)를 매개로 하이드록시라디칼 (OH-)로 전환시켜주는 철(Fe)에 의한 Fenton 반응을 glutathione peroxidase 효소의 증가된 활성에 의해 느리게 일어나도록 도와주어 미토콘드리아에서 생성된 활성산소종을 통제하여 산화 스트레스에 의한 세포사멸에 대해 선택적 저항성을 가지게 되는 것을 확인하였다. 척수에서도 운동신경세포가 산화 스트레스에 대해 선택적으로 dorsal horn neuron 에 비해 glutathione peroxidase 의 mRNA 및 단백질 활성이 상대적으로 낮아 인위적으로 산화 스트레스를 유발하였을 때 주변의 dorsal horn neuron 에 비해 선택적으로 세포사멸에 대한 민감성을 가지는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 산화 스트레스에 대한 선택적 세포 사멸 기전에 있어서 세포내 항산화 시스템을 구성하는 특정 항산화효소의 발현 수준의 차이가 선택적 신경세포 사멸과 산화 스트레스에 대한 민감도에 영향을 줄 수 있음을 보여준다. 핵심어: NADPH-d(+) 신경세포, 선조체, 산화 스트레스, 척수 ABSTRACT i TABLE OF CONTENTS iv LIST OF FIGURES vii LIST OF ABBREVIATION ix I. INTRODUCTION 1 PART I. Selective sparing of striatal NADPH-diaphorase neurons against oxidative stress: relevance to Huntington’s disease 1 A. Overview of Huntington’s disease 1 B. Excitotoxicity hypothesis in Huntington’s disease 1 C. Oxidative stress in Huntington’s disease 2 D. Hypothesis 3 E. Specific aims of the study 3 PART II. Vulnerability of spinal motor neurons to oxidative stress : relevance to amyotrophic lateral sclerosis 4 A. Overview of amyotrophic lateral sclerosis 4 B. Oxidative stress in amyotrophic lateral sclerosis 4 C. Hypothesis 5 D. Specific aims of the study 5 II. MATERIALS AND METHODS 7 A. Materials 7 1. Animals 7 2. Drugs 7 3. Reagents 7 B. Methods 8 1. Animal preparation 8 2. Striatal cell culture 8 3. Enzyme histochemistry for NADPH diaphorase 8 4. Induction of oxidative stress 9 5. Reverse Transcription (RT) 9 6. Polymerase Chain Reaction (PCR) 9 7. Administration of Mitotracker Red CM-H2XRos and Fe2+ in vivo 10 8. Tissue preparation 11 9. Immunohistochemistry 11 10. Analysis of mitochondrial free radical generation 11 11. Surgical Procedures and Intraspinal Microinjection of Fe2+ 12 12. DAB-enhanced Perls’ Staining 13 13. Single Cell RT-PCR 13 14. Fluorescent In Situ Hybridization 14 15. In Situ Detection of Total Mitochondrial ROS 15 16. Immunohistochemistry in spinal cords 16 17. Statistical analysis 16 III. RESULTS 18 PART I. 18 A. Sparing of cultured rat striatal NADPH-d(+) neurons against oxidative stress 18 B. Increased mRNA expression of the anti-oxidant enzymes in NADPH-d(+) neurons 22 C. Significantly reduced Mitochondrial ROS generation in NADPH-d(+) neurons upon exposure to Fe2+ and Menadione 26 D. Selective survival and reduced mitochondrial ROS generations in NADPH-d(+) neurons after being exposed to Fe2+ in vivo 30 PART II. 33 A. Intraspinal iron levels Increase Following Iron Microinjection 33 B. Spinal VMNs Are Vulnerable to Ferrous-Induced Oxidative Stress and Blocked by Trolox and Deferoxamine 35 C. Intraspinal Microinjection of Fe2+ Evokes Differential Increase of Mitochondrial ROS 38 D. Single cell analysis of GSHPx mRNA Expression is Lower in VMNs than in DHNs Permanent Occlusion of Middle Cerebral Artery (pMCAO) 41 E. FISH of GSHPx Antisense mRNA Is Lower in VMNs than in DHNs 43 F. GSHPx Protein is Differentially Expressed between DHNs and VMNs 46 IV. DISCUSSION 49 PART I. 49 Selective sparing of striatal NADPH-d(+) neurons against oxidative stress 49 PART II. 54 Low expression of glutathione peroxidase in spinal motor neurons vulnerable to oxidative stress 54 V. CONCLUSION 62 PART I. 62 PART II. 62 REFERENCES 63 국문요약 75 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 선조체 NADPH-d(+) 신경세포와 운동신경세포의 산화 스트레스에 대한 반응성에 관한 연구 Jeon Jeong Wook Thesis 아주대학교 일반대학원 Jeon Jeong Wook 일반대학원 신경과학기술과정 2012. 8 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000012743 산화 스트레스 신경세포