이용범 변수영 2007-02 2167 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16429 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :신경과학기술과정,2007. 2 근위축성측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)은 운동신경계만을 선택적으로 침범하는 치명적인 신경계 퇴행성질환 중 하나이다. 많은 병리기전이 이 질환에 관련되어 있지만, 선택적 운동신경세포 사멸의 원인은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 이에 본 연구는 근위축성즉상경화증 병리진행 과정에서 P2X_(7) 수용체에 의한 운동신경세포의 사멸기전에 대하여 알아보았다. ALS 의 유전자 변형 동물모델 생쥐 (G93A-SOD1)의 척수조직에서 운동신경세포 사멸과 더불어 운동신경세포의 세포막에 P2X_(7) 수용체가 과발현 되어 있으며, 초기 발병단계부터 시작하여 병리진행과 함께 발현이 증가함을 밝혔다. 또한 G93A-SOD1 생쥐의 발병 후기 단계에 면역염증세포인 마이크로글리아 에서도 P2X_(7) 수용체가 과 발현 되어있고, 이 수용체를 유도하는 것으로 알려져 있는 사이토카인인 IL-1b 역시 증가함을 확인하였다. 척수 마이크로글리아 세포를 배양하여 IL-1b에 의해서 P2X_(7) 수용체가 유도됨을 규명하였다. 이 수용체를 활성화시키는 것으로 알려진 BzATP 를 처리하여 마이크로 글리아에서 활성산소 (ROS)가 생성됨을 확인하였으며, 척수 신경세포와 마이크로글리아의 혼합배양을 이용하여, IL-1b에 의한 시너지 효과와 함께 이 기전을 통해 척수 신경세포의 사멸이 유도됨을 밝혔다. 본 연구를 통하여, G93A-SOD1 생쥐의 척수 운동신경세포 사멸 과정에 P2X_(7) 수용체가 관여되어 있음을 규명하였으며 P2X_(7) 수용체 매개 기전이 실제 ALS의 신경퇴행성사멸에 기여함을 예상할 수 있다. Ⅰ. Introduction = 1 Ⅱ. Materials and Methods = 4 1. Transgenic familial ALS mice and genotyping = 4 2. Primary culture of motor neurons and microglia = 4 3. Coculture of spinal cord motor neurons and microglia = 6 4. P2X_(7) antagonist injection = 6 5. Behavior test = 6 6. Western blotting = 7 7. Immunohistochemistry and immunofluorescence staining = 8 8. Total RNA isolation and RT-PCR = 9 9. Measurement of reactive oxygen species in microglia = 11 10. Quantitative analysis of cell death = 11 11. Statistical analysis = 12 Ⅲ. Result = 13 1. Up-regulation of P2X_(7) receptor in a transgenic mouse model of ALS = 13 2. Age-dependent correlation of motor neuronal P2X_(7) receptor expression with large motor neuron death in lumbar spinal cord of G93A-SOD1 mice = 13 3. Effects of intraperitoneal injection of the P2X_(7) receptor antagonist oATP on disease progression of G93A-SOD1 mice = 15 4. Microglial activation in lumbar spinal cord of G93A-SOD1 mice = 16 5. Expression of P2X_(7) receptor in activated microglia in the late stage of G93A-SOD1 mice = 17 6. Expression of IL-1β in G93A-SOD1 mice = 17 7. Characterization of primary spinal cord culture = 18 8. Induction of the P2X_(7) receptor expression in IL-1β-stimulated primary spinal cord microglia = 19 9. Neurotoxic effect of P2X_(7)-mediated microglial activation toward primary spinal cord neurons = 20 Ⅳ. Discussion = 33 Ⅴ. Reference = 37 국문요약 = 50 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 근위축성측삭경화증(ALS) 동물모델에서의 P2X_(7) 수용체의 발현과 이에 의한 운동성신경원 사멸기전 연구 Byun, Soo-Young Thesis 아주대학교 일반대학원 Byun, Soo-Young 일반대학원 신경과학기술과정 2007. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000002167 P2X7 receptor amyotrophic lateral sclerosis Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by selective motor neuron loss. Many pathological processes have been implicated, however, the cause of motor neuron death is poorly understood. This study aims to define the potential involvement of the P2X7 receptor in the devastation of motor neurons in disease progression of ALS. P2X7 receptor was up-regulated in motor neurons parallel with motor neuron death in lumbar spinal cord of G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS, showing a time-dependent up-regulation of P2X7 positive cells after early onset stage. In the late stage of G93A-SOD1 mice, P2X7 receptor expression was highly increased in microglia. IL-1beta, known to P2X7 receptor inducing cytokine in astrocytes, was also increased in astrocytes prior to over expression of microglial P2X7 receptor. Utilizing in vitro culture system, the induction of P2X7 receptor in primary spinal cord microglia was demonstrated by IL-1beta treatment. BzATP, a specific agonist of P2X7 receptor, stimulated reactive oxygen species (ROS) production in microglia. In turn, BzATP-stimulated microglia induced spinal cord neuron death with synergistic effect of IL-1beta. These observations demonstrated that either P2X7 receptor-mediated motor neuron cytotoxicity or microglial activation contributes to neurodegeneration in ALS pathology.