柳然禹 김승범 2005 161 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16362 학위논문(석사)--아주대학교 대학원 :분자과학기술학과 / 생체소재전공,2005 효소의 산업적 응용 가능성이 높아지면서 각각의 목적에 맞는 새로운 효소들에 대한 필요성이 증가하고 있다. 특히 높은 열이나 유기용매가 요구되는 공정에는 일반적인 생태계에서 분리한 효소를 사용하기에는 무리가 따른다. 극한 미생물 특히 90℃ 이상의 환경에서 자랄 수 있는 초 고온성 미생물들로부터 유래한 효소들은 매우 높은 열안정성가지고 있어, 그 이용 가능성이 매우 높다. 또한, 이 열안정성 효소들은 그 구조적 특징들로 인하여 단백질 변성제에 대한 내성이 크다고 알려져 있다. 이러한 열안정성과 단백질 변성제에 대한 내성은 효소의 산업화에 있어서 아주 중요한 조건중의 하나이다. 정밀화학 공정으로 생산되는 의약품과 구충제를 포함한 대부분의 화학제품들은 ester 화합물이고, 이들은 estease에 의해 가수분해가 이루어진다. Esterase는 높은 광학특이성과 더 불어 넓은 기질 수용성을 가지고 있어 화학 약품 합성이나 식품 생산 공정, 광학 분할 연구 등에 폭 넓게 이용되고 있다. 열안정성 esterase를 cloning 하기위하여 이미 전체 유전자 염기서열이 밝혀져 있는 극한 미생물을 대상으로 검색을 실시하여 Archaeoglobus fulgidus DSM 4304로부터 esterae로 추정되는 유전자를 찾아 cloning 하였다. 이 미생물의 전체 유전자의 염기 서열을 바탕으로 putative esterase의 증폭을 위하여 specific primer를 제작하고 PCR을 통해 E. coli XL1-Blue를 숙주로 하여 pQE30 vector에 cloning 하였다. 형질 전환체는 α-naphthyl acetate와 Fast Blue RR salt 또는 Fast Blue B salt를 이용한 activity staining을 통하여 쉽게 선별할 수 있었으며, 이 방법에 75℃에서 열처리하는 과정을 추가하여 열안정성을 확인하였고, LB agar 배지에 ketoprofen ethyl ester를 첨가하여 재조합 esterase의 ketoprofen ethyl ester에 대한 활성의 유무를 확인 할 수 있었다. Cloning 된 esterase는 총 247개의 아미노산으로 이루어 진 약 27.5 kDa의 분자량을 가진 monomer이었다. 단백질 서열 분석 결과 일반적으로 알려진 esterase의 active site인 G-X-S-X-G(GHSLG)의 반복서열을 나타내고 있다. ρ-Nitrophenol에 결합된 acyl chain의 길이에 따른 반응성에 대한 조사 결과 ρ-nitrophenylbutyrate(pNPC4)에 대하여 가장 높은 반응성을 보였고, 80℃에서 가장 높은 specific activity를 보였다. 탄소 사슬이 8개 이상인 ρ-nitrophenyl ester에 대한 활성은 급격히 감소하였다. Ketopfrofen ethyl ester를 기질로 사용한 경우에는 70℃ 에서 가장 높은 활성을 보였으며, 90℃에서 3시간 방치한 뒤로 약 10% 정도의 활성이 남아 있었다. pH 7과 pH 8에서 거의 비슷한 정도로 높은 활성을 보였다. Ketoprofen ethyl ester에 대한 Km 값은 1.6 mM 이었으며, Vmax는 1.7 μmole/mg protein/min이었다. Cloning 된 esterase는 기존에 보고된 중온성 esterase 보다 열안정성 면에서는 우수하지만, (R,S)-Ketopfrofen ethyl ester에 대한 enantioselectivity는 현저히 떨어진다. 따라서, error prone PCR, site directed mutagenesis와 DNA shuffling등의 in vitro protein evolution 기술을 통하여 열안정성과 함께 (R,S)-Ketopfrofen ethyl ester에 대한 높은 enantioselectivity를 가지는 mutant esterase를 찾는 연구가 계속 진행 되어야 할 것이다. 목차 List of Tables = ⅰ List of Figures = ⅱ 국문 요약 = ⅲ Ⅰ. 서론 = 1 1.1 연구배경 = 1 1.2 Estease의 일반적인 특징 = 4 1.3 Ketoprofen 이란 = 6 1.4 연구 목적 = 7 Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 8 2.1. 실험재료 = 8 2.1.1 시약 및 효소 = 8 2.1.2 사용 균주와 plasmid = 8 2.1.3 배지 및 배양 조건 = 10 2.2. 실험방법 = 12 2.2.1 Ketoprofen ethyl ester의 합성 = 12 2.2.2 Gene cloning = 12 2.2.2.1 PCR = 12 2.2.2.2 Plasmid 분리 = 13 2.2.2.3 DNA 전기영동 = 14 2.2.2.4 Restriction enzyme 처리 = 14 2.2.2.5 Ligation = 14 2.2.2.6 Electroporation 용 competent cell 제조 = 15 2.2.2.7 Transformation = 16 2.2.2.8 Screening = 16 2.2.2.9 재조합 esterase의 정제 = 17 2.3. 분석방법 = 18 2.3.1 염기서열 결정과 분석 = 18 2.3.2 단백질 정량 = 18 2.3.3 SDS-PAGE = 19 2.3.4 Native PAGE = 20 2.4 Esterase의 활성 측정 = 20 2.4.1 ρ-Nitrophenyl 유도체들에 대한 esterase의 활성 측정 = 20 2.4.2 Ketoprofen ethyl ester에 대한 esterase 활성 측정 = 21 2.4.2.1 Ketoprofen ethyl ester의 enzymatic resolution = 22 2.4.2.2 효소의 최적 온도 및 열 안정성 = 24 2.4.2.3 효소의 최적 pH = 24 2.4.2.4 유기용매와 계면활성제의 영향 = 24 2.4.2.5 Kinetic parameter 결정 = 25 Ⅲ. 결과 및 고찰 = 26 3.1 Esterase의 cloning과 아미노산 서열분석 = 26 3.2 재조합 esterase의 정제 = 29 3.3 ρ-nitrophenyl 유도체들에 대한 esterase의 활성 = 31 3.4 Ketoprofen ethyl ester에 대한 esterase의 활성 = 35 3.4.1 효소의 최적 온도 및 열 안정성 = 35 3.4.2 최적 pH = 36 3.4.3 유기용매와 계면활성제의 영향 = 40 3.4.4. Kinetic parameter 결정 = 41 Ⅳ. 결론 = 46 Ⅴ. 참고 문헌 = 47 Abstract = 54|List of Tables Table 1. Applications of enzymes and endogenous compounds from extremophiles = 3 Table 2. The medium composition of LB broth = 10 Table 3. The medium composition of GYT medium = 11 Table 4. The composition of SOC broth = 11 Table 5. Effect of various surfactants on the activity of the esterase. = 43|List of Figures Figure 1. pQE-30 vector for N-termial 6xHis tag construct = 9 Figure 2. Hydrolysis of ketoprofen ethyl ester = 23 Figure 3. DNA electroporesis of PCR product = 27 Figure 4. Transformant screening by activity staining = 27 Figure 5. DNA and Amino acid sequence of esterase = 28 Figure 6. SDS polyacrylamide gel electrophoration of purified recombinant esterase = 30 Figure 7. Substrate spectra of the esterase = 32 Figure 8. Temperature effect on the activity of the esterase = 33 Figure 9. Themostability of the esterase = 34 Figure 10. Effect of temperature on activity of the esterase against ketofrofen ethyl ester = 37 Figure 11. The thermosatability of the esterase against ketofrofen ethyl ester = 38 Figure 12. Effect of pH on the esterase activity of ketofrofen ethyl ester = 39 Figure 13. Effect of various solvent on the esterase activity = 42 Figure 14. Effect of substrate concentration on enzyme resolution of the esterase = 44 Figure 15. Determination of Km and Vmax = 45 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Archaeoglobus fulgidus로부터 내열성 esterase의 클로닝과 특성연구 Cloning and Characterization of Thermostable Esterase from Archaeoglobus fulgidus Thesis 아주대학교 일반대학원 일반대학원 분자과학기술학과 2005. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000161 As industrial application of enzymes is increased, there will be more needs of novel enzymes for new process. The major drawbacks limiting the industrial use of enzymes those from normal environment is their instability, mainly at high temperature, in operating industrial condition; therefore, the search for thermostable enzymes is important for the development of new applications. Hyperthermophilic microorganisms are the main source of new thermostable enzymes. It was reported that thermostable proteins show high tolerance to various denaturing conditions. Themormostability and tolerance to various denaturing conditions is one of the most important factors to apply enzymes for commercial use. Many man-made chemicals including drugs and pesticides are ester compounds. Their hydrolysis is catalyzed by esterases, a class of ubiquitous enzyme. Esterases exhibit high regio- and stereospecificity as well as broad substrate specificity, and are stable and even active in organic solvent, which make them attractive biocatalysts in the applications of fine chemical synthesis and food processing. In order to cloning of thermostable esterase, Archaea already published whole genome sequence were searched. A putative esterase from Archaeoglobus fulgidus DSM 4304 was found and cloned. Based on the genome sequence, specific primer for amplification for the putative esterase was synthesized, and after PCR the esterase gene was cloned into pQE30 vecter by E. coli XL1-Blue as a host cell. For transformant selection, activity staining using α-naphthyl acetate and Fast Blue RR salt or Fast Blue B salt was performesd. Thermostability of esterase was checked instantly by the modified method to addition 75℃ heat treatment and hydrolysis activity of esterase against ketoprofen ethyl ester was checked with LB agar medium including ketoprofen ethyl ester. Cloned esterases was about 27.5 kDa monomeric enzyme with 247 amino acids. It had the pentapeptide GHSLG corresponding to the GXSXG motif, which is the characteristic sequence at active site of esterase. This esterase showed the best activity against ρ-nitrophenylbutyrate(pNPC4) among the ρ-nitropheny derivatives and the optimal temperature was 80℃. In case that Ketopfrofen ethyl ester was used as a substrate, the optimal temperature was 70℃. The residual activity was about 10% for 3 hour incubation at 90℃. The activity was almost same at pH 7 and pH 8. The kinetic constants, Km and Vmax, of esterase toward rac-Ketoprofen ethyl este was 1.6 mM and 1.7 μmole/mg protein/min. Cloned esterase had grater thermostability than mesophilic esterase which was reported, however it has very low enantioselectivity against (R,S)-Ketopfrofen ethyl ester. Therefore, by in vitro protein evolution technics such as error prone PCR, site directed mutagenesis and DNA shuffling the study should be continued to generate mutant esterase that exhibit thermosablity with high enantioselectivity toward (R,S)-Ketopfrofen ethyl ester