문창현 박성례 2005 364 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16317 학위논문(석사)--아주대학교 대학원 :의학과,2005 목적: 세포부착분자는 혈관 병변 부위에서 TNF-α나 IL-β 등의 proinflamatory cytokine의 분비에 의해 혈관 내피세포 표면이나 백혈구세포에서 발현된다고 알려져 있다. 발현된 부착분자는 백혈구와 단핵구 등과의 세포 간 상호작용에 관여함으로써 일련의 염증반응을 매개하여 조직의 손상을 가속화한다고 알려져 있다. 이러한 염증반응에서의 부착분자 발현과정에 MAP Kinase pathway가 연관된다는 것을 시사하는 많은 연구결과가 보고 되었다. 따라서 본 연구에서는 혈액세포인 U937 세포에서 MEK/ERK 조절물질을 이용하여 부착분자의 발현조절과 MEK/ERK의 관계를 알아보고자 하였다. 재료 및 방법: U937 혈액세포를 사용하였으며, 2% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지 조건에서 MEK1/2 억제제인 U0126을 처리한 후 flow cytometry를 통해서 부착분자의 발현변화를 관찰하였다. 혈액세포에서 증가된 부착분자의 발현이 내피세포와의 부착에 관여하는지 adhesion assay를 통해서 관찰하였다. U0126의 작용이 세포생장에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. 부착분자의 발현을 증가시키는 U0126의 작용이 U937 세포에 특이적인 현상인지 알아보기 위해서 다른 종류의 세포주 즉, 혈관내피세포, T 림프세포, 섬유아세포에서 U0126에 의한 부착분자의 발현 변화를 confocal microscopy를 통해 확인하였다. 결과: U937세포에 U0126 (1, 3, 10, 20 μM)을 처리한 경우 U0126의 농도에 의존적으로 integrin-β2 (CD11b)와 L-selectin (CD62L)의 발현이 증가하였다. U937 세포와 bEnd.3 세포간의 부착반응 역시 U0126 (10μM)에 의하여 증가하였다. U0126은 부착분자의 발현을 증가시키는 농도 (1, 3, 10, 20 μM)범위에서 세포의 viability에는 별다른 영향을 미치지 않음을 MTT assay를 통하여 확인하였다. U0126은 농도 의존적으로 ERK의 활성을 억제하였다. U0126에 의한 부착분자의 발현증가에 관여하는 매개인자를 알아보기 위해 여러 억제제에 의한 영향을 관찰한 결과, trolox와 rottlerin을 전 처리했을 때 U0126에 의한 CD11b의 증가가 억제되었다. SN50과 LY90062을 처리했을 때에는 U0126에 의한 CD11b의 증가가 억제되지 않았다. U0126의 작용이 다른 종류의 세포에서도 나타나는 현상인지 U0126을 처리하여 알아본 결과, T 림프세포에서 U0126에 의해 CD11b의 발현이 증가되는 것을 관찰하였고, 뇌혈관세포와 섬유아세포에서 U0126에 의해 ICAM-1의 발현이 증가되지 않음을 확인할 수 있었다. 결론: 혈액세포인 U937 세포에서 MEK1/2 억제제인 U0126에 의하여 부착분자의 발현이 증가하는 현상을 확인하였다. U0126의 부착분자 증가작용과 U0126에 의한 ERK의 활성억제 작용 간에 correlation이 좋게 나타났으므로, 두 작용이 서로 연관되어있을 가능성이 시사되었다. 차례 국문요약 = ⅰ 차례 = ⅲ 그림 차례 = ⅴ 표 차례 = ⅵ 약어 = ⅶ Ⅰ. 서론 = 1 A. 세포부착분자 = 1 B. 세포부착분자와 신호전달 = 3 C. 연구 목적 = 5 Ⅱ. 재료 및 방법 = 6 A. 실험기기 및 시약 = 6 1. 실험시약 = 6 2. 실험기구 = 7 B. 연구방법 = 8 1. 세포배양 = 8 2. 실험조건 = 8 3. 세포사멸 측정: MTT assay = 8 4. 부착분자 측정: Flow cytometry = 9 5. 세포부착측정 = 9 6. 면역조직화학검사법 = 9 7. Western blotting = 10 8. 통계처리 = 10 Ⅲ. 결과 = 11 A. U0126에 의한 세포부착분자의 발현 변화 = 11 B. U0126에 의한 혈액세포와 내피세포간의 세포부착 = 11 C. U0126에 의한 세포생장 = 11 D. U0126에 의한 ERK MAPK의 활성 변화 = 17 E. U1026에 의한 부착분자 증가와 ROS와 PKC와의 연관성 = 17 F. U0126에 의한 다른 세포주에서 세포부착분자의 발현변화 = 17 Ⅳ. 고찰 = 26 Ⅴ. 결론 = 31 참고 문헌 = 32 ABSTRACT = 38 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 혈액세포에서 MEK1/2 억제제 U0126에 의한 부착분자의 발현 증가 U0126, MEK1/2 inhibitor, Induces Adhesion Molecules Expression in Human Blood Cells Thesis 아주대학교 일반대학원 Park, Sung Lyea 일반대학원 의학과 2005. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000364 B₂-Integrin (CD11b) and L-selectin (CD62L) adhesion molecule play crucial roles in monocyte transmigration and adherence to endothelial cells, causing inflammatory responses in vascular lesion. MAPKinase pathway has been known to be activated in inflammatory responses. In this study, we investigated the expression of adhesion molecule by MEK1/2 inhibotors such as U0126 in human blood cells, U937 cells. Cell viability was determined by MTT assay. The expression of adhesion molecule was observed by flow cytometry. Adhesion molecules were time- and dose-dependently incresed by U0126. U0126 decreased ERK activity in a concentration-dependent manner. To investigate the mechanism of U0126-induced adhesion molecules, we examined the effects of various inhibitors such as LY294002 (an inhibitor for PI3Kinase), trolox (antioxidant), rottlerin (an inhibitor for PKC-δ), and SN50 (an inhibitor for NF-kB) on U0126-induced adhesion molecule expression. Adhesion molecule expression was attenuated by rottlerin and trolox. In addition, to examine cell type specificity of U0126 effect on adhesion molecule, we investigated ICAM-1 expression in other cells including human T cells, brain endothelial cells and fibroblast cells. In bEnd.3 cells and NIH3T3 cells, U0126 had no effect on ICAM-1 expression. These results indicate that expression of adhesion molecule was increased by MEK1/2 inhibotors, such as U0126, in human blood cells and the expression of adhesion molecules may involve the downregulation of ERK MAPK pathway.