閔徹基 최승범 2005 273 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16285 학위논문(석사)--아주대학교 대학원 :생명과학과,2005 박테리아 K-ATP 채널 유전자를 동정하기 위해 토끼의 심근에서 클로닝된 K-ATP 채널 유전자인 Kir6.2 (AF455118) 유전자를 주형으로 하여 게놈의 일부 혹은 전체 서열이 밝혀진 모든 박테리아를 대상으로 PSI-BLAST 서치를 수행하여 아미노산 수준에서의 상동성을 검색하였다. 또한 K-ATP 채널을 동정하기 위하여 칼륨이온 선택적 투과막, 2개의 막 관통부위, 3차원 구조 등을 ClustalW1.83, 5개의 Transmembrane prediction site 그리고 Geno3D등으로 비교, 분석하여 동정하고자 하는 bacterial K-ATP 채널을 최종 선별하였다. 여기서 2개의 막 관통부위 (M1과 M2)는 α-helix 구조를, Pore (P)는 β-turn 구조를 각각 나타내며 이는 Kir에 속하는 K-ATP 채널을 동정하는데 유용한 수단을 제공하였다. 박테리아 K-ATP 채널의 3차 구조 예측은 기존의 구조가 밝혀진 이온채널(PBD ID : 1P7B)을 근거하여 모델링 되었다. 또한 토끼의 Kir6.2 채널과 5개의 균주들이 갖고 있는 잠정적인 박테리아 K-ATP 채널의 아미노산 수준에서의 상동성을 비교하여 이를 phylogenetic tree로 분석한 결과 토끼의 Kir6.2 채널과 잠정적인 박테리아Kir 6.2 채널간에는 23% 이상의 아미노산 상동성을 나타내었다. 앞에서 in silico 분석 방법으로 K-ATP 채널을 갖고 있을 박테리아 균주를 포함하여 50여개의 다른 박테리아를 대상으로 실제 박테리아 게놈에 채널유전자가 존재하는 지를 dot blot assay를 수행하여 확인하였다. In silico 분석에서 두 개의 막 관통구조를 가지며 K-ATP 채널을 가질 확률이 높은 균주들은 모두 dot blot 실험에서 양성으로 판명되었다. 클로닝에 사용된 벡터로는 (1) 단백질 과발현, (2) 발현 단백질의 정제 그리고 (3) Xenopus oocyte를 이용한 이형발현에 사용될 cRNA 제작 등이 용이한 His-tag과 T7 promoter를 갖는pET30b(+) vector (Novagen, USA)를 사용하였다. 박테리아 K-ATP 채널 유전자는 in silico에서 상동성 예측으로 얻어진 잠정적인bacterial K-ATP 유전자들의 보존된 서열을 근거로 적합한 primer를 사용하여 PCR 방법으로 얻었다. 합성된 PCR 산물은 적절한 제한효소로 절단하여 벡터에 삽입하였다. 유전자 클로닝을 위하여 DH5a E. coli strain을 사용하였고, 단백질 발현을 위하여는 BL21 DE3 strain (Novagen)을 사용하였다. 발현된 채널 단백질을 확인하기 위해 단백질 C-말단에 위치하는 His-tag을 인식하는 일차항체 (Rabbit polyclonal antibody, Santa Cruz Biochemical)를 사용하여 Western blot을 수행하였다. 최종적으로 박테리아에서 클로닝된 K-ATP 채널 유전자가 실제로 기능을 하는 유전자인지를 알아보기 위해서 pET30b(+) vector의 T7 promoter를 이용하여 클로닝된 박테리아의 K-ATP 의 cRNA를 합성한 후 이렇게 만들어진 cRNA 일정량을 Xenopus oocyte에 미세주입 2-3일 후에 TEVC 표준 방법을 이용하여 whole-cell current를 측정하였다. 그 결과 mammalian K-ATP 채널에서의 inward rectifier current를 나타내었고, 이러한 새로운 박테리아 K-ATP 채널의 동정은 차후 구조를 분석을 위한 crystallography 이용될 것이며 박테리아 K-ATP 채널의 구조와 기능 연구 결과는 심장에서 허혈 전처치의 목표 단백질인 심근 K-ATP 채널에 응용되어 새로운 치료약물의 개발에 응용될 것이다. CONTENTS ABSTRACT = 4 CONTENTS = 5 CONTENTS OF FIGURES = 6 INTRODUCTION = 7 MATERIALS AND METHODS = 10 In silico analysis = 10 Molecular biology = 10 Dot blot assay = 11 Expression of bacterial Kir6.2 in E.coli = 12 Electrophysiology = 13 RESULTS = 14 Identification of putative bacterial Kir6.2 in silico = 14 Probe cross hybridization = 15 Molecular cloning and in vitro transcription = 15 Protein expression of putative bacterial K-ATP channel in E. coli = 16 Electrophysiological properties of putative bacterial Kir6.2 = 16 CONCLUSION = 18 References = 34 국문요약 = 38 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Identification and characterization of a bacterial ATP-sensitive potassium (K-ATP) channels 박테리아 ATP-민감 칼륨채널의 동정 및 특성 연구 Thesis 아주대학교 일반대학원 Choi, Seung Bum 일반대학원 이학계열 2005. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000273 Five bacterial strains that have putative bacterial K-ATP channels were selected based on the in silico homology analysis against the rabbit heart inward rectifier K^(+) channel (Kir6.2). Further, an in silico analysis enabled us to predict the number of transmembrane domains (TMs), putative 3-D structure and ATP binding sites of the channel proteins. These analyses indicated that Chromobacterium violaceum (CV) have a gene encoding K-ATP channels with the highest probability. A result from the dot blot assay probed with rabbit Kir6.2 gene further supported the in silico analysis in that the hybridization is bigger in bacterial strains that showed high probabilities for the putative K-ATP channel. A bacterial K-ATP genes were PCR-cloned into the bacterial expression vector pET30b(+), and IPTG induced the production of the K-ATP channel proteins in E. coli, which were confirmed in Western Blot. The electrophysiological properties of the putative bacterial K-ATP channel was test by using heterologous expression of bacterial K-ATP channels in Xenopus oocyte and two electrode voltage clamping (TEVC). The TEVC revealed a K^(+) current characteristic of mammalian K-ATP channels. Our results indicates that cloning and characterization of ion channels could be greatly facilitated by using in silico analysis.