南碩鉉 김승현 2005 398 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16283 학위논문(석사)--아주대학교 대학원 :생명과학과,2005 오랜 시간에 걸쳐 인체에 대한 약리작용과 안정성을 검증받아온 한약재를 이용하여 현대사회의 심각한 문제 중 하나인 환경오염으로 인한 여러 가지 질병을 치료할 수 있는 신 물질을 찾기 위한 연구가 새롭게 각광받기 시작함에 따라 항산화 효과가 높은 것으로 밝혀진 40종의 한약재를 선별하여 NO(Nitric Oxide)의 활성을 조사하였다. 항산화효능은 기존에 이미 DPPH 자유라디칼에 대한 전자공여능 및 Fenton 반응에 의해 생성되는 -OH소거능을 측정하여 밝혀낸 것이며, macrophage에서는 iNOS의 발현에 의한 NO생성으로 침입한 미생물이나 종양 세포를 죽이는 등 생체내 방어기작에 중대한 역할을 하고 있다. 따라서 활성산소종의 일원이지만 생체내 면역반응에 중요한 역할을 하는 NO에 초점을 맞추어 각각의 시료를 macrophage에 처리하였을 때 발생하는 NO의 양을 측정하는 실험을 시작하였다. 곽향의 경우, 비활성화된 macrophage에서 고농도의 NO를 생성하였고, 활성화된 경우에도 동일한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 곽향이 macrophage를 활성화시킨다는 것을 의미하며, 곽향이 어떤 경로에서 작용하여 NO활성을 높이는지 알기 위해 NO생성 억제자로 작용하는 N^(G)-MMA와 PDTC를 처리하여 각각의 경우를 조사하였다. 그 결과 N^(G)-MMA의 경우 inhibitor의 농도가 높을수록 곽향에 의한 NO생성에 어느 정도 억제 효과를 보이고 있으며, LPS나 IFN-γ와 같은 자극원을 처리한 경우에도 각각의 대조군을 비교해 보았을 때 어느정도 억제효과가 나타났다. 또한, PDTC를 처리한 결과 NO생성 억제가 약 50%이상 이루어졌고, LPS, IFN-γ를 처리하였을 때에도 마찬가지로 NO생성 억제효과가 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과는 곽향이 L-argine에 대한 경쟁적 억제자로 작용하는 N^(G)-MMA보다는 NF-κB의 발현을 억제하는 PDTC의 영향을 더 많이 받는다는 것을 의미하며, 곽향이 NF-κB의 발현에 영향을 주고 있음을 알 수 있다. 곽향이 iNOS단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blot assay를 실행하였다. 그 결과 macrophage를 활성화시키지 않은 경우에도 iNOS단백질의 발현량이 대조군에 비해 상당히 높았으며, 이것은 곽향이 iNOS의 발현량을 증가시킴을 의미한다고 할 수 있다. 곽향에 의한 발현량 증가가 전사단계에서 이루어지는지 알아보기 위해 RNA를 추출해 RT-PCR을 실행하여 확인하였다. 또한 iNOS의 발현시 연관되어 나타나는 염증반응 cytokine인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현에 미치는 영향도 함께 알아보았다. 그 결과 iNOS와 염증관련 cytokine인 TNF-α, IL-1β, IL-6에서 모두 곽향을 처리하였을 때 그 발현량이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합해보면 곽향은 다른 자극물질없이도 macrophage를 활성화시켜 면역기능을 수행할수 있게 만드며, NO의 발생에 있어서 전사조절인자인 NF-κB를 활성화시켜 iNOS의 합성을 증가하게 만든다. 또한 그에 따른 염증반응 cytokine인 TNF-α, IL-1β, IL-6등의 발현도 촉진시킨다고 할 수 있다. 이러한 기능을 가진 곽향에 대한 좀 더 자세한 연구가 이루어 진다면 면역기능 약화에 대한 새로운 치료제로서의 가치가 충분하리라 사료된다. 목차 국문요약 = 1 목차 = 3 그림 및 표 목차 = 4 Ⅰ. 서론 = 1 Ⅱ. 재료 및 방법 = 5 1. 재료 및 추출 = 5 2. 세포배양 = 5 3. Griess method를 이용한 NO활성 측정 = 5 4. MTT assay에 의한 cell viabillaty 측정 = 6 5. Western blot assay를 이용한 iNOS 발현량 측정 = 7 6. RT-PCR에 의한 염증반응 관련 cytokine의 발현검증 = 8 Ⅲ. 결과 및 고찰 = 9 1. 한약재 시료선별과 LPS 유무에 따른 NO활성 측정 = 9 2. Inhibitor에 의한 NO생성 억제측정 실험 = 13 2-1. N^(G)-MMA 처리에 따른 NO활성 억제 측정 = 13 2-2. PDTC에 의한 NO생성 억제 측정 = 17 3. Western blot assay에 의한 iNOS 발현량 비교 = 21 4. RT-PCR을 통한 cytokine의 발현량 비교 = 23 Ⅳ. 결론 = 32 Ⅴ. 참고문헌 = 34 Abstract = 37 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 곽향이 대식세포에서 NO생성과 cytokine의 발현에 미치는 영향 Effect of the aqueous extract of Pogostemi Herba on Nitric oxide synthesis and activation of cytokine in macrophage Thesis 아주대학교 일반대학원 Kim, Seung Hyun 일반대학원 이학계열 2005. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000398 Agastache rugosa O.Kuntze is used to treat several bacterial diseases. It was tested the effect of Agastache on Nitric Oxide(NO) production using RAW264.7 cells. When Agastache was used without LPS(100ng/ml), there was a lot of NO production. Agastache was treated with NO product inhibitors such as N^(G)-MMA and PDTC in macrophage. When Agastache was used with N^(G)-MMA (200uM), there was a little inhibition about NO production. And with PDTC(100 uM) there was inhibited about 50% in NO production. In addition, when macro phage was stimulated by Agastache, iNOS protein synthesis was incresed because of the promotion of NF-κB activation. And Agastache was incresed mRNA production in transcription level. When the macrophage is activated by LPS, macrophage product NO and cytokines. When Agastache has treated in macrophage, The production of TNF-α, IL-1β, IL-6 incresed. These finding demonstrated that Agastache increased the production of NO and iNOS protein. Also the production of TNF-α, IL-1β and IL-6 has been incresed in macrophage by Agastache. It means that NF-κB played a important role in mediating the effects of Agastache.