Junghee Seo 2005 180 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/16245 학위논문(박사)--아주대학교 대학원 :생명과학과,2005 배아 줄기세포 (Embryonic stem cell) 에 Retrovirus를 삽입해서 계속해서 분열하도록 만들어진 혈구세포(EB-PE)를 통해서 일련의 세포 불멸화에 관련된 유전자를 발견했으면 이 유전자를 Ris2라고 명명하였다. Ris2단백질의 아미노산 서열은 다른 종들과 비교 분석을 통해서 이 Ris2 단백질은 개구리와 사람의 Cdt1과 초파리의 DUP 유전자와 높은 유사성을 나타냈다. 이러한 염기서열상의 유사성을 통해서 Ris2유전자가 쥐에서의 Cdt1상동 유전자라고 생각되어진다. 유전물질을 안정하고 정확하게 다음세대의 딸 세포에 전달하기위해서는 세포분열의 시기동안 세포 내 전체 염색체 DNA를 완벽하고 정확하게 복제를 하는 것이 무엇보다 중요하다. 진핵세포에서의 DNA 복제는 오직 licensing protein이라고 명명되는 일련의 단백질들이 DNA상에 정확한 순서로 복합체를 형성한 위치에서만 시작될 수 있다. Licensing protein은 ORC (개시점 인식단백질) Cdt1, Cdc6, Mcm2-7들로 구성되며 이들 단백질들은 ORC 을 시작으로 해서 Cdt1, Cdc6, Mcm2-7의 순서로 복합체를 형성한다. 이들 licensing protein 중 본 연구의 대상이 되는 Cdt1은 Mcm2-7 의 결합을 위한 중요한 요소로서의 기능을 갖다 Ris2/Cdt1유전자의 발현정도를 사람의 다양한 암세포에서 비교하였을 때 모든 암세포들에서 높은 수준으로 발현되는 것을 알 수 있었으며 한편, 이러한 Ris2 유전자를 과발현 하는 변형된 섬유 아 세포를 면역이 결핍된 쥐에 주사하였을 때 암세포 덩어리가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 위의 변형된 섬유 아세포를 세포분열의 G0/G1단계 (세포분열을 준비하는 단계)로 성장을 정지시켰다가 다시 성장을 유도 하였을 때 Ris2 유전자를 과 발현 하는 변형된 섬유 아 세포가 대조구의 세포들에 비해서 빠른 속도로 S 단계 (세포분열을 위한 DNA 복제시기)로 이동하는 것을 관찰 할 수 있었다. 생체내에서 암이 발생하는데 Ris2/Cdt1의 양향을 알아보기 위해서 Cdt1을 흉선에서 특이적으로 과발현하도록 하였을 때 28개월의 관찰을 통해서 4마리의 쥐에서만 림프구에 비 정상적인 세포덩어리가 생겼다. 그런데, P53 단백질이 그 기능을 하지 못해서 불완전한 세포분열을 억제하지 못하도록 만들어진 쥐에 Cdt1을 흉선에 특이적으로 과발현하도록 했을 때 T 형 림프구세포에서 암유발이 과속화되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 Cdt1 유전자의 과발현은 p53단백질이 기능을 하지 못하는 상태에서만 비정상적인 DNA복제를 유도할 수 있다는 이전에 보고된 결과와 일치하는 것으로 세포배양 수준에서의 결과와 일치하는 것으로 DNA 전사에 관련된 단백질이 비정상적으로 발현 되었을 때 이 유전자가 생체내에서 암을 유발할 수 있다는 것을 제안한다. 다른 licensing protein 인 Cdc6와 MCM2-7과 같이 Cdt1 또한 그 발현정도를 정상세포가 종양으로 진행되는 상태를 진단할 수 있는 하나의 표지유전자로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. TABLE OF CONTENT 국문요약 = 1 ABSTRACT = 3 TABLE OF CONTENT = 4 LIST OF FIGURES = 6 LIST OF TABLES = 7 ABBREVIATION = 8 CHAPTER I. INTRODUCTION = 9 1.1. Initiation of DNA replication = 10 1.2. Components of the pre-replication comples = 10 1.2.1. The Origin Recognition Complex = 10 1.2.2. CDC (The Cell Division Cycle) 6 Protein = 12 1.2.3. The CDT(Cdc 10 Dependent Transcript) 1 Protein = 12 1.2.4. The Mcm2-7 Protein Complex = 13 1.3. Prevention of Re-Replication = 13 1.3.1. CDK-Mediated prevention of Re-Replication = 14 1.3.2. Regulation of Pre-Replicative Complex Formation by Geminin = 14 1.4. p53-deficient mice = 15 1.4.1. Introduction of p53-deficient mice = 15 1.4.2. Function of Cdt1, Geminin, and p53 in cancer = 16 1.4.3. The licensing proteins in cancer = 18 CAHPTER 2: Results = 21 2.1 MATERIALS = 22 2.1.1. Materials = 22 2.1.2. Flow Cytometry Reagents = 22 2.1.3. Animals = 22 2.1.4. Cell culture = 23 2.1.5. Generation of hybridomas = 25 2.1.6. Antibody production and purification = 27 2.1.7. Flow Cytometry = 28 2.1.8. Histological analysis = 29 2.1.9. cDNA generation = 30 2.1.10. Full length ris cDNA and genomic clone isolation = 31 2.1.11. Tumor formation = 32 2.1.12. Western blot analysis = 32 2.1.13. In vitro transcriptin and translation = 32 2.1.14. Plasmids. = 33 2.1.15. Aging Studies = 33 2.1.16. Cell proliferation assay = 34 2.2 Isolation and Characterization of Ris/Cdt1 = 34 2.2.1. Isolation of Ris2/Cdt1 cDNA = 34 2.2.2. RIS2 sequence similarity to Xenopus, Drosophila, and human CDT1 = 35 2.2.3. Activation of Ris2/Cdt1 in EB-PE cells and human tumor cells = 38 2.2.4. Generation and characterization of hamster monoclonal antibodies against mouse Cdt1 = 42 2.2.5. Cdt1 and Geminin binding = 44 2.2.6. Mapping the CDT1 functional domain = 48 2.3. Oncogenic potential of Ris2/Cdt1 = 55 2.3.1. Tumor formation in from Ris2/Cdt1 overexpressing cells = 55 2.3.2. Ris2/Cdt1 in cell cycle regulation = 60 2.4. p53 dependent in vivo oncogenic potential of the Cdt1 = 63 2.4.1. The generation and characterization of Lck^(pr)-Cdt1 = transgenic mice = 64 2.4.2. Tumor susceptibility of Lck^(pr)-Cdt1;p53^(+) mice = 70 2.4.3. The T-cell development in p53^(+) and Lck^(pr)-Cdt1;p53^(+) mice = 76 2.4.4. The cell proliferation rate and apoptosis in tumor = 84 2.4.5. The status of cell cycle regulation proteins = 85 CHPATER Ⅲ. Discussion and Conclusion = 89 Reference = 95 eng The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. p53 dependent oncogenic potential Thesis 아주대학교 일반대학원 Seo, Junghee 일반대학원 이학계열 2005. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000000180 The exact duplication of chromosomal DNA during each cell cycle ensures the correct inheritance of genetic material from mother to daughter cells. Therefore, accurate DNA replication is critical for maintaining genetic stability. In eukaryotic cells, DNA replication can occur only when the origin of DNA replication is accurately marked by a group of proteins termed licensing proteins. One such protein is Cdt1, which is recruited first to the origin of DNA replication followed by cell division cycle 6 (Cdc6) and mini-chromosome maintenance proteins (Mcms). The mouse Cdt1, which was isolate due to its activation by retroviral DNA integration, was expressed at high levels in all human tumor cell lines analysed. Consistently, NIH3T3 fibroblasts overexpressing Cdt1 formed tumors in Rag2^(+) mice when injected subcutaneously. Cells overexpressing Cdt1 exhibited a quicker entry into S phase when released from serum starvation, arrested at G0/G1 phase, compared to controls. Transgenic mice expressing Cdt1 in thymocytes were generated to investigate whether Cdt1 overexpression could result in uncontrolled cell proliferation. Mice with T-cell directed Cdt1 overexpression did not show any abnormal T cell growth. However, in the absence of p53 resulted in thymic lymphoblastic lymphoma. Previous studies indicated that p53 checkpoint mechanism could block DNA rereplication, which was induced by Cdt1 overexpression. The implication then is that p53 is one component that can restrict DNA replication to one round per cell cycle. Cdt1 overexpressing cells became cancerous only when p53 was inactivated. Collectively, our studies demonstrate that Cdt1, a DNA replication licensing protein, can be oncogenic in the absence of p53 function.