이상윤 최주용 2019-08 29324 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/15432 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2019. 8 원형질 막에 존재하는 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5) P2)는 세포 표면에서 많은 세포 생리학적 과정의 필수 지질 조절제이다. PI (4,5)P2는 주로 PIP5Kα, PIP5Kβ 및 PIP5Kγ를 포함하는 type I phosphatidy-linositol 4-phosphate 5-kinase (PIP5K) family에 의해 생성된다. 각각의 PIP5K 동형 단백질들은 특정한 막 구획에서 뚜렷한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 여기서, 우리는 autophagy의 규제에 PIP5Kα의 잠재적인 역할을 연구하였다. 우리는 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 PIP5Kα knockout (KO) 위암 세포를 만들었고 PIP5Kα KO의 효과를 혈청 결핍에 의해 유발된 자가포식작용 흐름에 대해 조사하였다. 자가포식작용의 활성화는 면역 블롯 분석을 통하여 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로 전환되는 것을 볼 수 있었다. 우리는 시간 별로 혈청 결핍을 하였을 때, 대조군에 비해서 PIP5Kα KO 세포에서 LC3-Ⅱ 수준이 상대적으로 높게 유지된다는 것을 발견하였다. PIP5Kα KO세포에서 촉매 적으로 비활성화된 것이 아닌 야생형PIP5Kα를 재구성하여 자가포식작용을 회복시켰으며, LC3-Ⅱ의 수준이 증가된 후 감소되었다. 이러한 결과와 잘 일치하여 PIP5Kα의 억제제는 자가포식작용의 후기 단계에서 LC3-Ⅱ가 축적을 유도하였다. 이러한 결과를 통하여PIP5Kα에 의한 PI(4,5)P2생성은 자가포식작용에 필요하다는 것을 시사한다. 현재 우리는 autolysosome 형성 과정에서 PIP5Kα가 관여할 가능성을 시험해보고 있다. 또한 우리는 ATG (autophagy-related gene) 단백질 중 하나인 ATG5와 PIP5Kα가 결합하는 것을 확인하였다. 그리고 ATG5가 CAT 도메인에서 더 강한 결합을 하는 것을 보았다. 그래서 우리는 ATG5와 PIP5Kα의 결합이 어떻게 자가포식작용에 영향을 미치는지 찾고 있는 중이다. 국 문 요 약. ⅰ 차 례. ⅲ 그 림 차 례 ⅴ 사 용 약 어 ⅵ Ⅰ. 서론 1 1.1 Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase typeⅠα(PIP5KⅠα) 와 Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate(PI(4,5)P2). 1 1.2 자가포식작용. 5 1.3 실험 목적. 7 Ⅱ. 실험재료 및 방법. 9 2.1 시약 및 항체 9 2.2 세포 배양 9 2.3 WESTERN BLOTTING 10 2.4 약물 처리. 11 2.5 CRISPER/ CAS9. 11 2.6 면역침강반응(Immunoprecipitation) 12 Ⅲ. 결과 3.1 PIP5Kα가 없을 때 자가포식작용의 결함 13 3.2 자가포식작용 내 PIP5Kα의 촉매 활성 분석 15 3.3 자가포식작용 유발하였을 때 PIP5Kα의 위치 변화 분석 18 3.4 자가포식작용 결합 단계에서의 PIP5Kα의 기능 분석 20 3.5 PIP5Kα와 ATG5 간의 결합력 분석 22 3.6 ATG5 와 PIP5Kα의 결합 간 PIP5Kα의 결합 부위 분석 25 Ⅳ. 고찰 및 결론 27 Ⅴ. 참고 문헌 30 그 림 차 례 Figure 1. Membrane lipid. 3 Figure 2. PIP5K isoforms and PIP2. 4 Figure 3. Autophagy flux. 8 Figure 4. PIP5Kα activates autophagy flux 14 Figure 5. Autophagy flux dependent on PIP5Kα catalytic activity. 16 Figure 6. Suppression of autophagy flux by PIP5Kα inhibitor 17 Figure 7. PIP5K translocates to the LC3-positive membranes upon autophagy induction 19 Figure 8. PIP5Kα activates fusion of autophagosome and lysosome 21 Figure 9. PIP5K binds to ATG5. 23 Figure 10. PIP5K colocalizes with ATG5 upon autophagic induction. 24 Figure 11. PIP5K binds to ATG5: more strong affinity with CAT domain 26 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. 자가포식작용을 조절하는 지질 효소 PIP5Kα 에 대한 연구 JUYONG CHOI Thesis 아주대학교 일반대학원 JUYONG CHOI 일반대학원 의생명과학과 2019. 8 Master I804:41038-000000029324 http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/common/orgView/000000029324