김홍표 우승제 2015-02 19507 https://aurora.ajou.ac.kr/handle/2018.oak/13059 학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :약학,2015. 2 미토콘드리아는 전자 전달 및 산화적 인산화 과정을 통해 세포 에너지를 생산하며 세포 사멸 신호 전달 경로에 관여하는 등 중요한 역할을 한다. Heme은 미토콘드리아 기능과 산소 소비에 있어 중요한 역할을 한다. Succinylacetone(SA)은 heme생합성 경로에 관여하는 두 번째 효소인 δ- aminolevulic acid dehydratase의 강력한 억제제이다. 우리는 heme결핍으로 인한 인간대장암 세포의 증식 및 생존을 저해하는 분자학적 기전을 검토했다. 우리는 결장암 세포가 SA에 대해 다르게 반응한다는 것을 보여주었다. HCT116 세포가 가장 민감하게 반응하였고 SW480세포는 SA에 대한 손상이 거의 없었으며, HT29세포는 중간쯤 위치한다. Heme 생합성은 미토콘드리아에서 주로 일어나기 때문에 미토콘드리아의 기능을 중심으로 실험을 하였다. 대장암세포를 투과 전자 현미경(Transmission electron microscope, TEM)을 통해 관찰한 결과 HT29세포에서 가장 뚜렷하게 미토콘드리아가 손상되었음을 보았다. 반면에, SA에 가장 낮은 세포생존율을 보인 HCT116 세포에서는 큰 차이가 없었다. Heme결핍이 미토콘드리아의 어떤 기능에 영향을 미치는지를 pyruvate dehydrogenase complex (PDH)와 전자 전달계 두 부분으로 나눠 실험을 하였다. HCT116세포는 TCA cycle에 필요한 acetyl-CoA를 만들어내는 PDH의 활성이 감소하였음을 보여주었으며, HT29세포는 미토콘드리아의 전자 전달계에서 complex III의 활성이 감소하였음을 보여주었다. 전반적으로 SW480세포는 SA에 대해 반응을 보이지 않았다. HCT116세포는 에너지를 호기성 해당과정을 통해 생산해내는 것을 밝혔고, HT29세포는 미토콘드리아에서 산화적 인산화 반응을 통해 에너지를 만들어 낸다는 것을 밝혔다. 이를 통해 SA에 대해 서로 다른 메커니즘을 통해 반응한다는 것을 보여주었다. 목차 국문요약 LIST OF FIGURES iii LIST OF ABBREVATION iv I. 서론 1 1. 암세포에서의 물질대사 1 2. PDH에 의한 pyruvate 에서 acetyl-CoA로의 전환과정 4 3. 미토콘드리아에서의 에너지 대사 과정 7 4. 미토콘드리아와 세포질에서의 heme 생합성 과정 9 5. 미토콘드리아에 의한 세포사멸 11 II. 실험재료 및 방법 13 1. 실험재료 13 1.1. 기기 및 기구 13 1.2. 시약 14 2. 실험방법 17 2.1. 세포 배양(Cell culture) 17 2.2. 세포 생존율 측정(MTT assay) 17 2.3. Western biot 분석 18 2.4. 투과전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM)을 이용한 미토콘드리아 관찰 19 2.5. 세포 내 PDH 활성 측정 19 2.6. 미토콘드리아 전자 전달계 활성 측정 20 2.7. 세포 내 ATP 농도 측정 20 2.8. 통계학적 분석 21 III. 결과 22 1. 인간 대장암세포는 succinylacetone에 대해 다르게 반응 한다. 22 2.Succinylacetone에 의한 암세포에서의 미토콘드리아 형태 변화는 HT29세포에서 가장 민감하게 반응한다. 25 3. Succinylacetone은 HCT116세포에서만 PDH의 활성을 감소 시킨다. 29 4. Heme결핍은 HT29세포에서만 미토콘드리아 전자 전달계의 활성을 감소시킨다. 31 5. 미토콘드리아 전자전달계의 활성 감소로 인한 ATP함량 감 소는 세포사멸로 이어진다. 33 IV. 고찰 36 V. 결과 41 VI. 참고문헌 42 ABSTRACT 47 LIST OF FIGURES Figure 1. Metabolic differences between normal and cancer cells 3 Figure 2. Pyruvate dehydrogenase-catalyzed oxidative decarboxylation of pyruvate 5 Figure 3. Activation of pyruvate dehydrogenase enzyme complex control by phosphorylation and dephosphorylation cycle 6 Figure 4. Hyperglycemia-induced production of superoxide by the mitochondrial electron transport chain 8 Figure 5. Overview of heme synthesis 10 Figure 6. Apoptosis signalling through mitochondria 12 Figure 7. Differential vulnerability of human colon cancer cells treated with SA 24 Figure 8. Cancer cell-specific alteration in mitochondrial morphology by SA treatment 27 Figure 9. SA attenuates PDH activity in HCT116, but not in HT29 and SW480 cells 30 Figure 10. Reduced activity of ETC in HT29 cells by SA 32 Figure 11. A decline in totoal cellular ATP levels determines a human colon cacer cells vulnerability by SA 35 kor The Graduate School, Ajou University 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다. Succinylacetone으로 인한 미토콘드리아 기능 장애 및 에너지대사 감소에 따른 대장암세포에서의 세포사멸 Woo Seung Je Thesis 아주대학교 일반대학원 Woo Seung Je 일반대학원 약학 2015. 2 Master http://dcoll.ajou.ac.kr:9080/dcollection/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000019507 대장암세포 succinylacetone heme apoptosis ATP