Gasdermin E 매개 칼슘 이온이 세포고사 엑소좀 생합성에 미치는 영향 - 강대욱 (The Graduate School, Ajou University, 2023)
Gasdermin 계열 단백질은 세포막에 구멍을 만들어 파이롭토시스 (pyroptosis)를 일으키는 단백질로 최근에 밝혀졌다. 우리 연구실에서는 Gasdermin 계열 단백질들이 세포고사 엑소좀 (apoptotic exosome) 생합성에 관여하는 것을 규명하였다. Gasdermin 계열 단백질 중에서 세포고사 엑소좀 방출량이 가장 높은 Gasdermin E로 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 Gasdermin E가 엑소좀 생성량을 증가시키는 것을 보기 위해 Gasdermin E를 발현 시켜 생성된 엑소좀 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. Gasdermin E가 세포고사 엑소좀 생합성에 관여하는지 확인하기 위해 엑소좀 마커인 CD63을 과발현한 HeLa 세포를 공초점 현미경 (confocal microscope)으로 확인하였고, 세포질 내 칼슘 이온이 세포고사 엑소좀 생합성에 관여하는지 확인하기 위해 세포질 내 칼슘 이온을 efluor™ 514 칼슘 이온 센서 염료로 확인하였다. 그 결과 엑소좀 양을 엑소좀 마커 S1PR1, S1PR3, CD63으로 확인하여 Gasdermin E가 발현될 때 엑소좀 방출량이 증가하는 것을 확인하였다. HeLa 세포에서는 생합성에 중요한 multivesicular bodies (MVBs) 성숙 (maturation) 과정이 세포질 막 근처에서 발생하는 것을 확인하였는데, Gasdermin E-녹아웃 세포에서 MVBs 성숙 과정이 발생하지 않았고 세포 내 intraluminal vesicles (ILVs)를 포함한 MVBs 수가 감소하였음을 확인하였다. 세포질 내 칼슘 이온 농도에 따라 세포고사 엑소좀 방출량을 알아보았는데 칼슘 이온 농도 조절을 하기 위해 칼슘 이온 킬레이트제 (BAPTA-AM, 50 μM), 칼슘 이온 운반체 (A23187, 1 μg/ml) 를 HeLa 세포, Gasdermin E-과발현 시킨 HeLa 세포, Gasdermin E-녹아웃 HeLa 세포에 처리하여 엑소좀 양을 측정하였는데 세포질 내 칼슘 이온이 증가할 때 엑소좀 방출량이 증가하는 것을 확인하였고, 세포질 내 칼슘 이온이 감소할 때 엑소좀 방출량도 감소하는 것을 확인하였다. 칼슘 이온을 제거한 배지와 칼슘 이온이 존재하는 배지로 세포질 내 칼슘 이온을 측정하였는데 세포 밖 칼슘 이온 여부와 상관없이 세포질 내 칼슘 이온 농도가 증가한 것을 확인하였다. 즉 칼슘 이온은 Gasdermin E로 인해 만들어진 엔도솜 막 구멍을 통해 엔도솜 내강에서 세포질로 유입 되고 세포질 내 칼슘 이온 농도가 증가함에 따라 세포고사 엑소좀 생성량이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 Gasdermin E는 엑소좀 생합성에서 중요한 과정인 MVBs 성숙에 관여하고 Gasdermin E로 인해 생성된 엔도솜 막을 통해 세포질 내로 칼슘 이온이 유입 되어, 칼슘 이온이 세포고사 엑소좀 생합성에 관여하는 것을 밝혔다.
학위논문(석사)--아주대학교 일반대학원 :의생명과학과,2023. 2
Keywords: 엑소좀