고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 유발되는 췌장베타세포의 기능이상 연구 - 신하철 (The Graduate School, Ajou University, 2006)
배경 및 목적 : 제2형 당뇨병은 전 세계적으로 가장 흔하고 심각한 대사 질환이다. 정상인의 췌장베타세포는 혈중 포도당 농도 조절에 중요한 인슐린을 합성 및 분비하는 중요한 역할을 수행하고 있다. 현재 베타세포의 기능이상은 인슐린 저항성과 함께 제2형 당뇨병을 유발시키는 중요한 병인으로 인식되고 있다. 포도당은 베타세포의 기능을 조절하는 가장 중요한 조절자로서 특히 베타세포의 인슐린 유전자 발현과 생합성, 분비에 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 포도당이 고농도로 오랫동안 베타세포에 노출될 때, 베타세포의 기능이상을 초래하며, 이러한 현상을 당독성이라 한다. 당독성을 설명하고 있는 정확한 기작을 아직 잘 알려져 있지 않으나, 지속적으로 고혈당에 노출되면 베타세포 내 활성산소가 발생되고 산화 스트레스를 유발시켜 베타세포에 악영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 백서의 베타세포주인 INS-1 세포에서 고농도 포도당에 지속적으로 노출되었을 때 인슐린 유전자 발현과 그의 전사에 중요한 전사인자들 중의 하나인 pdx-1 유전자 발현이 억제되는 데, 이와 관련된 기작을 연구하고자 하였다. 대상 및 방법: 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의하여 베타세포의 중요한 기능 중 하나인 인슐린 유전자 발현이 감소하는 지를 확인하기 위해, 백서의 소도세포와 세포주, 마우스 세포주를 대상으로 RT-PCR 방법을 이용하여 인슐린 및 주요 전사인자의 유전자 발현을 확인하였다. 이후 고농도 포도당에 의한 전사인자, 특히 pdx-1 의 발현 감소가 어떤 단계의 이상때문인지를 확인하기 위해 mRNA, 단백질 안정성, translocalization, 프로모터 활성을 조사하였다. 다음으로 인슐린 프로모터의 어느 부위가 고농도의 포도당에 의해 영향을 받는 지, pdx-1 유전자 발현에 중요한 전사인자는 어떤 것인지를 확인하였다. 또한 이러한 현상과 관련된 기작을 찾기 위해 다양한 대사 억제제 및 신호전달 억제제를 사용하여 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 감소된 프로모터 활성이 회복되는 지를 조사하였다. 결과: INS-1 세포에서 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 인슐린과 pdx-1 유전자 발현이 포도당 농도 의존적이고 시간 의존적으로 감소하는 현상을 관찰하였다. 또한 이렇게 감소된 인슐린과 pdx-1 mRNA는 5 mM 포도당에 다시 배양할 경우, 발현이 회복되는 가역적 반응을 나타내었다. PDX-1을 과발현시킬 경우, 고농도 포도당에 의해 감소된 인슐린 mRNA가 부분적으로 회복되었고, INS-1 pdx-1 유전자의 5‘ 프로모터 부위에 의해 발현이 조절되는 lucferase reporter 유전자를 INS-1 세포에 transient 또는 stable transfection 과정을 통해 도입한 결과, 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 pdx-1 프로모터 활성이 감소하는 것을 관찰하였다. 그러나 pdx-1 mRNA와 단백질의 안정성 및 PDX-1 translocalization에는 영향이 없었다. 이러한 결과를 통해 고농도 포도당의 지속적 노출에 의해 야기되는 인슐린과 pdx-1 유전자 발현의 감소현상은 pdx-1 프로모터 활성의 감소가 주원인으로 추정된다. 그리고 pdx-1 유전자 발현에 있어서 MafA와 HNF-3β와 PDX-1의 자가조절이 중요한 것을 확인하였다. 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 pdx-1 프로모터 활성의 감소현상과 관련하여 기존에 중요하다고 알려져 있는 ROS는, 항산화제 처리하였을 시 아무런 영향이 없는 것으로 볼 때 INS-1 세포에서는 중요하지 않는 것을 확인하였다. 포도당 대사에 있어서 glucokinase 저해제인 mannoheptulose는 25 mM 포도당의 지속적인 노출에 의해 감소된 pdx-1 프로모터 활성을 완전히 회복시키고, 세포내 glucose-6-phosphate의 축적을 촉진시키는 2-deoxy-glucose와 octanoate는 5 mM 포도당에서 프로모터 활성을 저해시키는 것으로 볼 때, 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 glucose-6-phosphate의 세포내 과량 축적이 INS-1 세포에서의 pdx-1 프로모터 활성을 감소시키는 데 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 또한 성장과 관련된 세포주기 억제제나 ERK 저해제가 프로모터 활성을 부분적으로 회복시키는 것으로보아, 고농도 포도당에 의해 베타세포의 증식이 촉진되고, 이와 동시에 베타세포의 탈분화 (dedifferentiation) 기작으로 pdx-1 프로모터 활성이 억제될 가능성을 시사한다. 이에 비해 troglitazone은 PPAR-γ와 관련 없이 5 mM 포도당에서 pdx-1 프로모터 활성을 감소시켰고, 25 mM 포도당 조건에서 AICAR 의 경우는 AMPK의 활성과 관련 없이, 비특이적으로 프로모터 활성을 부분적으로 회복시켰고 LY294002 또한 PI3-kinase와 관련 없이, 비특이적으로 프로모터 활성을 완전히 회복시켰다. GSK3 저해제인 SB216763은 저농도 포도당에서 프로모터 활성을 감소 시켰는데, 이것 또한 마찬가지로 GSK3의 활성과 관련 없이 핵 속의 PDX-1 단백질을 세포질로 이동시키는 형태로 pdx-1 프로모터 활성을 감소시켰다. 결론: 본 연구를 통해, INS-1 베타세포에서는 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 인슐린 유전자 발현이 감소되고, 이러한 현상은 주요 전사인자인 pdx-1의 프로모터 활성이 감소하기 때문인 것으로 밝혔다. 또한 이러한 현상은 현재 까지 가장 잘 알려진 ROS에 의해 유발되는 것은 아니고 고농도 포도당의 지속적인 노출에 의해 세포 내 glucose-6-phosphate의 축적과 활발한 세포 증식이 pdx-1 프로모터를 감소시킬 것으로 추정 된다.
학위논문(박사)--아주대학교 일반대학원 :의학과,2006. 8
Keywords: 베타세포 기능이상; INS-1; 고혈당; pdx-1 프로모터 활성; glucose-6-phosphate; 탈분화